Combinaison innovante des approches ELISA et "Digital Droplet PCR" pour améliorer le diagnostic précoce des candidémies
Thierry Mourer
Découverte d’AltLMNA, une protéine provenant d’une deuxième séquence codante fonctionnelle dans le gène Lamine A/C
Hélène Mouilleron
Des peptoïdes perméants comme transporteurs de molécules imperméables à travers la membrane cellulaire.
Andréanne Laniel
Étude de Hry1, une nouvelle cible de Php4 contenant un domaine hémérythrine
Ariane Brault
Étude de la signalisation du récepteur AT2.
Alexandre Connolly
Étude du clivage de p23 par la caspase-7
Cyrielle Martini
Étude du recrutement et de la fonction de la recombinase RAD52 dans la réparation des fourches de réplication de l'ADN
Jean-Christophe Dubois
Functional Characterization of AltB2R, an Alternative Protein Encoded in the Bradykinin B2 Receptor Gene Involved in the B2R Signaling
Maxime Gagnon
FUS is a dual-coding gene: both proteins cooperate for the worst in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)
Marie Brunet
Identification de nouveaux substrats qui interagissent avec l’exosite de la caspase-7
Marie-Anne Bilodeau-Laforest
Identification de partenaires protéiques de TMPRSS6, une protéase impliquée dans l’homéostasie du fer et l’obésité
Sébastien Dion
Identification d’Ubiquitine Ligases Impliquées dans la Protection du Génome Humain
Billel Djerir
Identification of structural determinants of biased signaling of the apelin receptor
Laurent Bruneau Cossette
La caspase-7 interagit avec plusieurs domaines de PARP-1
Alexandre Desroches
La vitamine C oxydée catalyse la glutathionylation et l'homocystéinylation de la Glutaredoxine-1
Ahuié Grace Kouakou
Macrocycle as tool to modulate the in vivo stability and agonistic properties of pyr-apelin-13 peptide
Kien Tran
Modes d'intéraction non canoniques entre le récepteur met et l'isoforme p66 de la proteine shc et sa dualité fonctionnelle
Jesús Gerardo Contreras Ojeda
OpenProt unveils yet unseen depth of proteomes
Sebastien Leblanc
Optimisation de l’activité et de la sélectivité d’agonistes des récepteurs neurotensinergiques
Michael Desgagné
Optimisation d’inhibiteurs de la matriptase-2
Méryl-Farelle Oye mintsa mi-mba
Régulation de la stabilité du génome par les E3 ubiquitine ligases PRP19 et RFWD3
Maïlyn Yates
Structural and dynamic characterization of UbKEKS, a newly identified ubiquitin encoded in a pseudogene
Patrick Delattre
Structure determination of disease associated peak AAA from L-Tryptophan implicated in the eosinophilia-myalgia syndrome (EMS)
Chad Normandin
Validation de l’implication de Gq/11 dans l’activation du canal TRPC6 par AT1R à l’aide d’un biosenseur BRET
Audrey Collette
Vers le développement d’une nouvelle génération d’inhibiteurs de l’oncoprotéine c-Myc
Jean-Michel Moreau

Combinaison innovante des approches ELISA et "Digital Droplet PCR" pour améliorer le diagnostic précoce des candidémies


Thierry Mourer1, Vincent Normant1, Cynthia Grenier1, Marie-Pier Guay1, Jude Beaudoin1, Mathieu Durand1, Louis Valiquette1, Alex Carignan1, Martin Bisaillon1, Simon Labbé1
1Université de Sherbrooke

Parmi les levures pathogènes, les levures du genre Candidareprésentent la 4èmecause d’infection nosocomiale systémique. Il est estimé que 250 000 personnes à travers le monde souffrent d’une infection systémique à Candia albicansdénommée candidémie. Les candidémies sont associées à un fort taux de mortalité (>40%) malgré la présence d’antifongiques disponibles sur le marché. De plus, le diagnostic tardif des candidémies compromet fortement les chances de survie des patients. Devant l’augmentation exponentielle du nombre de patients candidémiques, il y a un besoin urgent d’améliorer le diagnostic et le traitement des infections systémiques à Candida albicans. La séquestration du fer (Fe) par les mammifères est reconnue de longue date comme un mécanisme de défense contre les pathogènes invasifs. En conséquence, les levures pathogènes ont développé différentes stratégies pour dérober le Fe de l’hôte. Ainsi, l’acquisition du Fe à partir de l’hème fait partie de ces mécanismes. Chez Candida albicansl’acquisition d’hème exogène fait intervenir deux protéines extracellulaires ancrées à la membrane plasmique et fortement exprimées dans le sang de patient qui sont Pga7 et Rbt5. Ici, nous soulevons l’hypothèse qu’un anticorps anti-Pga7 représente un outil immunologique puissant pour détecter, par la technique d’ELISA, la présence deCandida albicansdans le sang de patients infectés. En complément, nous présentons une approche de type « Droplet Digital PCR » permettant de déterminer si une candidémie est dûe à une espèce albicansou non-albicans. La combinaison de ces deux approches permettra une avancée majeure dans ladétection rapideet le traitement précoce des candidémies qui sont cliniquement très complexes à diagnostiquer et à traiter.

Découverte d’AltLMNA, une protéine provenant d’une deuxième séquence codante fonctionnelle dans le gène Lamine A/C


Hélène Mouilleron1,3,4, Vivian Delcourt1,2,3,4, Sondos Samandi1,3,4, Jean-François Jacques1,3,4, Xavier Roucou1,3,4
1Faculté de Médecine et des Sciences de la Santé, Département de Biochimie, Pavillon de Recherche Appliquée sur le Cancer, Université de Sherbrooke, Québec, Canada 2Université de Lille, INSERM U1192, Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire & Spectrométrie de Masse (PRISM) F-59000 Lille, France 3Regroupement stratégique PROTEO, Université Laval, Québec, Canada 4PROTEOMEUS, Université de Sherbrooke, Québec, Canada

Les lamines de types A (LMNA), codées par le gène Lamine A/C, sont des composantes de la lamina nucléaire. Celle-ci donne sa forme et sa stabilité à l’enveloppe nucléaire. De plus, de nombreuses mutations dans le gène Lamine A/C ont déjà été identifiées comme étant responsables de laminopathies telles que la Progeria, des cardiomyopathies ou encore des dystrophies musculaires.

 

Nous avons ré-analysé le transcriptome de différents organismes et avons détecté des milliers de nouvelles séquences codantes, différentes des séquences codantes de référence. Ces séquences, dites alternatives, peuvent se trouver dans des CDSs (Coding DNA Sequences) déjà connues ou dans les UTRs (Untranslated Regions). Elles codent pour des protéines qui sont totalement différentes des protéines de références. Nous avons notamment découvert que le gène codant pour LMNA pourrait également coder pour une protéine alternative AltLMNA. Cette protéine alternative, au même titre que sa protéine de référence, est sujette à des mutations et pourrait donc avoir un rôle à jouer dans diverses pathologies.

 

Nous avons montré par immunobuvardage que LMNA et AltLMNA sont coexprimés dans des cellules HeLa. Par la suite, il a été démontré par immunofluorescence que la protéine AltLMNA, tout comme sa protéine de référence, possède une localisation nucléaire. Dans le but d’avoir des indices quant à la fonction de cette protéine, les partenaires d’interaction d’AltLMNA ont ensuite été identifiés par co-immunoprécipitation suivie d’une analyse par spectrométrie de masse. Ainsi, nous savons qu'AltLMNA interagit avec des protéines impliquées entre autre dans le cycle cellulaire : PSME3 et CENPV. Au vu de ces résultats, nous avons décidé d'étudier le comportement d’AltLMNA au cours du cycle cellulaire. Pour ce faire, nous utilisons des cellules HeLa synchronisées aux différentes phases du cycle. Il a ainsi été démontré que la localisation d'AltLMNA est étroitement liée au cycle cellulaire. En phase S, AltLMNA possède une localisation périnucléaire. De plus, il a été observé qu'AltLMNA transloque du noyau vers les mitochondries durant la mitose.

 

Enfin, AltLMNA interagit avec PSME3, une protéine également impliquée dans la réponse aux cassures double-brin de l’ADN (CDB). Nous avons pu constater par immunofluorescence et gel d’électrophorèse en champ pulsé (PFGE) que la surexpression d’AltLMNA conduit en effet à la production de CDB. Ces cassures pourraient partiellement expliquer les maladies sus-citées telle que la Progeria qui se caractérise par un vieillissement accéléré des enfants atteints dû notamment à la présence de nombreux dommages à l’ADN. Ceci est d’autant plus vrai que nous avons observé qu’AltLMNA s’échappe des noyaux des cellules progériques, qui sont très déformés. En effet, si PSME3 est un acteur important de la réparation des cassures double-brin de l’ADN, le fait qu’AltLMNA l’entraine hors des noyaux en cas de Progeria coïnciderait avec la présence de ces nombreux dommages.    

Des peptoïdes perméants comme transporteurs de molécules imperméables à travers la membrane cellulaire.


Andréanne Laniel1, Etienne Marouseau1, Éric Marsault2, Christine Lavoie3
1Université de Sherbrooke 2Université de Sherbrooke 3Université de Sherbrooke

La membrane cellulaire est la barrière protégeant la cellule. Elle permet de contrôler l’échange entre les milieux extra- et intracellulaire. Il y a donc plusieurs classes de molécules qui ne peuvent la traverser. Ainsi, la découverte de peptides perméants ayant la capacité de traverser les membranes cellulaires a permis d’élargir la gamme de molécules capables de les traverser. Dérivée de ces peptides, la classe des transporteurs riches en guanidines (TRGs), s’est avérée prometteuse pour le transport de divers cargos imperméables. Dans notre étude, plusieurs constructions synthétiques de TRGs ont donc été préparées afin d’évaluer et de comparé le niveau de pénétration cellulaire des TRGs, ainsi que leur cytotoxicité chez des cellules HeLa. Par la suite, l’objectif est de caractériser l’internalisation de nos constructions synthétique.

 

À l’aide de la cytométrie de flux, nous avons testé la pénétration de nos TRGs à 5μM en mesurant la fluorescence moyenne de leur cargo, la fluorescéine. Les résultats ont montré que les composés commençaient à passer significativement la membrane cellulaire à partir de 6 guanidines et avaient une pénétration optimale avec 8 guanidines. Nous observons ainsi une absorption cellulaire maximale pour PGua4 (8 guanidines), avec 80% d’absorption de notre contrôle positif, la nonaarginine (R9).

 

À l’aide de la microscopie confocale, nous avons déterminé la distribution cellulaire de R9 et PGua4 chez des cellules HeLa vivantes. Ces peptoïdes s’accumulent tous deux dans les endosomes précoces et seront majoritairement recyclés à la membrane à des concentrations de 5μM. Toutefois, il ne semble pas y avoir d’évasion endosomale à cette concentration, c’est donc pourquoi nous établirons la courbe de concentrations correspondant à l’évasion endosomale de ces peptoïdes.

 

Pour l’instant, PGua4 est le TRG pénétrant le mieux dans les cellules HeLa. Plusieurs autres TRGs, pour lesquels on a introduit des modifications structurales vis-à-vis de la structure de PGua4, seront testés et les peptoïdes ayant le taux de pénétration le plus élevé seront caractérisés par microscopie confocale. Cette étude nous permettra de mieux comprendre comment les TRGs entrent dans la cellule, afin d’envisager la conjugaison et la livraison de molécules d’intérêt incapables de traverser les membranes cellulaires.

 

Étude de Hry1, une nouvelle cible de Php4 contenant un domaine hémérythrine


Ariane Brault1, Samuel Plante1, Marie-Claude Carrier1, Éric Massé1, Simon Labbé1
1Université de Sherbrooke, Département de biochimie

Une micropuce à ADN en méiose a permis d’identifier plusieurs nouvelles cibles méiotiques potentielles de Php4. Une protéine particulièrement intéressante, à cause de la présence d’un domaine hémérythrine, a ainsi été identifiée : Hry1. Jusqu’à maintenant, aucune étude n’a été faite sur cette protéine, qui est la seule à posséder un tel domaine chez les levures, à l’exception de quelques cas répertoriés chez les levures filamenteuses. Les domaines hémérythrines sont connus pour occuper plusieurs fonctions physiologiques importantes chez différents organismes, incluant l’homme. Chez certaines protéines, incluant celle chez l’homme, ce domaine joue un rôle de senseur du statut en fer (Fe). Chez les bactéries, ce domaine agit notamment au niveau de la réponse au stress oxydatif et au stress causé par le NO.

Dans le laboratoire, nous avons d’abord confirmé que Hry1 est régulé par le statut en Fe et par le facteur de transcription Php4 par protection à la RNase (RPA) et par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Nous avons continué l’étude de la protéine en caractérisant sa stabilité par rapport au statut en Fe dans le milieu de croissance. Par immunobuvardage du type Western, nous avons pu démontrer que la protéine est stabilisée par la présence de Fe dans l’environnement. Nous avons ensuite débuté les expériences pour élucider la fonction de Hry1 en l’exprimant de façon hétérologue dans une bactérie E. coli qui ne possède plus le gène ytfE. Cette stratégie nous a permis de vérifier la capacité de la souche bactérienne à croître en présence de peroxyde d’hydrogène selon la présence ou l’absence de Hry1. L’expression de Hry1 semble bel et bien réinstaurer la croissance malgré le stress oxydatif, suggérant que la protéine est impliquée soit au niveau de la protection aux dommages ou dans la réparation de ces derniers.

Hry1 est donc une nouvelle cible de Php4 impliquée dans la réponse au stress oxydatif. L’expression et la stabilité de la protéine à domaine hémérythrine sont régulées par le statut en Fe dans le milieu de croissance. Finalement, une caractérisation plus approfondie est nécessaire pour mieux comprendre son implication dans la réponse fongique au stress oxydatif (et potentiellement au stress causé par le NO) qui arrive fréquemment dans l’environnement.

Étude de la signalisation du récepteur AT2.


Alexandre Connolly1, Brian Holleran1, Laurent Bruneau Cossette1, Philippe Marin2, Pierre Lavigne1, Jean-Patrice Baillargeon1, Richard Leduc1
1Université de Sherbrooke 2Université de Montpellier

Résumé

Le récepteur de type 1 à l’angiotensine (AT1) est une cible thérapeutique bien caractérisée, mais une nouvelle cible émergente du système rénine-angiotensine est le récepteur de type 2 à l’angiotensine (AT2). En effet, notre laboratoire a montré qu’un médicament stimulant ce récepteur était bénéfique dans des modèles animaux de diabète de type 2 ou de syndrome des ovaires polykystiques (SOPK). Par contre, la signalisation d’AT2 reste toujours énigmatique.

Objectifs : 1) Caractériser la signalisation du récepteur AT2 à l’aide de biosenseurs BRET, 2) Identifier des déterminants structuraux conférant au récepteur AT2 sa signalisation atypique, et 3) Analyser le phosphoprotéome résultant d’une stimulation d’AT2.

Résultats :

Nos expériences BRET ont permis de démontrer qu’AT2, de façon atypique, n’engendrait pas l’activation des biosenseurs associés aux protéines Gq/i ou aux β-arrestines de façon ligand dépendante et qu’il présentait une activité constitutive de type Gi (objectif 1).

Pour caractériser ces derniers résultats, nous avons construit des récepteurs chimériques entre AT2 et AT1, ce qui nous a permis d’identifier des déterminants structuraux importants, dont l’ICL1 (objectif 2). En effet, la substitution par exemple de l’ICL1 d’AT2 dans le récepteur AT1 donne une chimère incapable de signaler via les voies canoniques sans toutefois entraver son expression ou sa capacité de lier l’angII. De plus, les simulations de dynamique moléculaire (MD) corroborent ces résultats puisqu’ils nous indiquent que les mutations déstabilisent la structure tertiaire des récepteurs.

Pour l’objectif 3, l’analyse du phosphoprotéomes est en cours et sera disponible bientôt.

Conclusion : Ce projet a permis jusqu’à maintenant de caractériser la signalisation d’AT2 et d’identifier des déterminants structuraux importants lui conférant son profil signalétique atypique. Ces données pourront être utiles dans le développement de nouveaux traitements pour des pathologies comme le SOPK.

Étude du clivage de p23 par la caspase-7


Cyrielle Martini1, Mikaël Bédard1, Pierre Lavigne1, Jean-Bernard Denault1
1Université de Sherbrooke

Les caspases sont une famille de peptidases à cystéines impliquées dans l'apoptose et l'inflammation. Au cours de l'apoptose, des centaines de protéines sont clivées par les caspases exécutrices 3 et 7, qui partagent le même motif de substrat préféré DEVD. Cependant, bien que la caspase-3 est plus active que la caspase-7, cette dernière est meilleure pour cliver certains substrats, y compris p23 la cochaperone d’Hsp90. En effet, notre groupe a précédemment montré que la caspase-7 utilise un exosite (K38KKK) dans son domaine N-terminal (DNT) qui est critique pour la protéolyse efficace de PARP1. L'implication de cet exosite dans le clivage d'autres substrats reste à démontrer.

Pour caractériser l'exosite de la caspase-7, nous avons effectué des délétions successives du DNT et montré que les résidus 36-45 étaient impliqués dans la reconnaissance de p23. Puis, grâce à des  substitutions alanine simples et multiples, nous avons démontré que contrairement à PARP1, l'exosite de la caspase-7 ne semble pas dépendre uniquement des lysines, bien que leur contribution soit significative.

p23 est une protéine globulaire de 160 acides aminés constituée d'un noyau en feuille β (résidus 1 à 110) et d'une queue C-Terminale non structurée (CTT, résidus 111 à 160) contenant le site de clivage. Pour identifier le site de liaison de l'exosite de la caspase-7 sur p23, nous avons remplacé le corps de p23 replié en feuillets β par la GST (une protéine globulaire de taille similaire à p23). Les essais de clivage utilisant cette protéine chimère montrent que la caspase-7 n'interagit pas avec le corps de p23. La relation structure-activité du CTT de p23 révèle que l'exosite de la caspase-7 interagit avec ce domaine en amont du site de clivage.

Enfin, nous avons étudié la contribution du résidu proline à la position P4 sur le clivage de p23 par la caspase-7. La substitution de la proline en P4 pour un aspartate a seulement amélioré le clivage de 4 fois, ce qui est inférieur à ce qui était attendu sur la base de petits substrats peptidiques. La substitution du résidu P4 avec les dix-huit autres acides aminés naturels met en évidence de nombreuses différences entre les préférences de clivage de la caspase-7 sur un substrat peptidique et dans le contexte d'une protéine.

Sur la base de nos résultats et d’analyses bioinformatiques, nous proposons un modèle de reconnaissance moléculaire entre la caspase-7 et p23 dans lequel des déterminants moléculaires transitoires dans le DNT de la caspase-7 contenant l'exosite et dans le CTT de p23 s'associent pour améliorer la reconnaissance du substrat.

Étude du recrutement et de la fonction de la recombinase RAD52 dans la réparation des fourches de réplication de l'ADN


Jean-Christophe Dubois1, Maïlyn Yates1, Alexandre Maréchal1
1Université de Sherbrooke

Les cellules cancéreuses sont fréquemment soumises à un stress réplicatif qui constitue une source majeure d’instabilité génomique durant l’oncogenèse. Ce stress est provoqué par plusieurs facteurs (lésions à l’ADN, déplétion des nucléotides,…) et mène à l’effondrement des fourches réplicatives. Pour remédier à cette situation, les cellules possèdent des voies de réparation leur permettant de diminuer les conséquences néfastes de ce stress. En dernier recours, une voie de réparation est induite durant la mitose afin de compléter la réplication avant la division cellulaire. Cette voie est contrôlée par la recombinase RAD52, mais le mode de recrutement de RAD52 aux fourches réplicatives endommagées est très mal caractérisé dans les cellules humaines et les partenaires de RAD52 durant la réparation mitotique ne sont pas connus. Nous présentons ici les résultats de nos travaux visant à élucider ces deux aspects de la biologie de RAD52. Nous démontrons que RAD52 est recruté aux fourches endommagées par le complexe de liaison à l’ADN simple-brin RPA. Des expériences de protéomique ont aussi permis d’identifier plusieurs interacteurs constitutifs et induits par le stress réplicatif de RAD52. Nos travaux permettront de mieux comprendre cette voie de réparation mitotique qui permet aux cellules cancéreuses de survivre au stress réplicatif. Inhiber cette voie pourrait constituer une stratégie pour augmenter l’efficacité des traitements basés sur l’induction de stress réplicatif.

Functional Characterization of AltB2R, an Alternative Protein Encoded in the Bradykinin B2 Receptor Gene Involved in the B2R Signaling


Maxime Gagnon1,2,3,4,5, Martin Savard1,3, Jean-François Jacques1,2,4,5, Fernand Gobeil1,3, Xavier Roucou1,2,4,5
1Université de Sherbrooke 2Pavillon de Recherche Appliquée sur le Cancer 3Institut de Pharmacologie de Sherbrooke 4PROTEO 5Proteomeus

Functional and proteomic approaches have concurrently demonstrated the translation of alternative open reading frames (AltORFs) in addition to the annotated coding sequences (CDSs) present on the same mRNA. These AltORFs may be encoded in the UTRs in any reading frame or overlapping the annotated CDS in a different reading frame. Hence, translation potentially produces multiple proteins in addition to the annotated protein. For clarity, proteins translated from the annotated CDS are termed reference protein and proteins translated from AltORFs are termed alternative proteins.

Our studies focus on the multicoding potential of G protein-coupled receptor (GPCR) genes. This superfamily of protein, containing over 830 members, is widely studied for its therapeutics potential. We predict that over 4 600 AltORFs are potentially encoded on GPCR genes’ transcript, of which nearly 36% overlap the reference CDS. This means the study of these ~600 GPCRs using a heterologous expression system potentially includes the expression of over 1 600 AltORFs. Amongst those is the gene coding for the bradykinin B2 receptor (B2R) which codes for an AltORF termed AltB2R. As a proof of concept, our study focuses on the functional characterization of AltB2R.

Our results demonstrate that AltB2R is co-expressed with B2R from the same coding sequence. AltB2R, a cytoplasmic protein, interacts with its reference protein as shown by bi-molecular fluorescence complementation. Functional assays investigating B2R signalling cascade were performed on stable cell lines; one over-expressing AltB2R and one negative control. Endogenous B2R stimulation led to a significantly stronger MAPKs activation in cells over-expressing AltB2R. Moreover, intracellular calcium signalling in response to agonist stimulation was increased in the presence of AltB2R. Next, we designed a mutated B2R (B2R*) where the amino acid sequence of B2R was unchanged, but we mutated a CAA codon of AltB2R to the TAA stop codon. This construction allows for the expression of B2R while effectively stopping the expression of AltB2R.  Functional assays comparing B2R and B2R* constructs showed a decreased MAPKs activation in B2R* transfected cells following agonist stimulation. Furthermore, these cells showed a significantly decreased IP3 generation in response to B2R stimulation. However, there was no difference in ligand binding nor B2R internalization efficiency. Finally, the AltB2R protein has been identified in different brain and breast cancers by mass spectrometry and immunohistochemistry using a custom antibody specifically targeting AltB2R.

These results indicate that AltB2R is a novel regulator of B2R signalling. Since B2R is known for being involved in certain types of cancer (notably brain cancer), our future studies will aim at determining whether AltB2R plays an integral role in these pathologies.

FUS is a dual-coding gene: both proteins cooperate for the worst in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)


Marie Brunet1, Sonya Nassari1, Vivian Delcourt1,2, Jean-François Jacques1, Steve Jean1, Xavier Roucou1
1Université de Sherbrooke 2Université de Sherbrooke - Université de Lille

Le gène FUS est impliqué dans plusieurs maladies neurodégénératives telles que la SLA. Plusieurs mutations sont connues, perturbant notamment le signal de localisation nucléaire de la protéine canonique, FUS. Les caractéristiques pathologiques incluent une inhibition de l’autophagie, une dysfonction mitochondriale et une accumulation cytoplasmique de la protéine FUS autrement nucléaire. Toutefois, les mécanismes impliqués restent à élucider. Par ailleurs, de nombreuses études ont maintenant démontré l’importance fonctionnelle de protéines dites alternatives. Ces protéines sont encodées dans des ARNs annotés comme non-codants, ou bien dans les UTRs d’ARN messagers ou chevauchant la CDS dans un autre cadre de lecture. A l’aide de notre base de données (OpenProt), nous avons remarqué que le gène FUS encodait pour une seconde protéine (altFUS). OpenProt regroupe les protéines alternatives prédites ainsi que des évidences de conservation, traduction et expression; altFUS y est prédite comme chevauchant la CDS. OpenProt indique aussi qu’altFUS est conservée et détectée par profilage ribosomal et spectrométrie de masse. Est-il donc possible qu’altFUS soit impliquée dans les caractéristiques pathologiques de la SLA?

AltFUS est une protéine mitochondriale, exprimée de façon endogène dans des lignées cellulaires et des tissus humains. Elle interagit avec des protéines impliquées dans la régulation de l’autophagie, de la fonction mitochondriale et de la protéostasie; caractéristiques altérées dans la SLA. Plusieurs expériences biochimiques ont permis de démontrer le rôle nécessaire d’altFUS dans l’inhibition de l’autophagie et la baisse de potentiel mitochondrial observés lors de la SLA. L’expression de la protéine FUS mutée ne provoque ces phénotypes qu’en présence d’altFUS. AltFUS seule ne permet pas d’aboutir à ces phénotypes non plus, soulignant la nécessité des deux protéines. De plus, les cellules exprimant altFUS présentent des agrégats cytoplasmiques de FUS plus nombreux et plus volumineux. La taille et le nombre d’agrégats cytoplasmiques étant connus pour être corrélés avec la sévérité du phénotype, nous avons regardé le rôle d’altFUS dans le modèle drosophile de la SLA liée à FUS. Les mouches exprimant la protéine FUS mutée mais n’exprimant pas altFUS présentent une détérioration de leur activité locomotrice moindre que celles exprimant les deux protéines. Les mouches exprimant altFUS seule présentaient une activité locomotrice normale, démontrant une coopération fonctionnelle entre FUS et altFUS dans la SLA.

AltFUS est une nouvelle protéine, découverte via OpenProt, importante dans la SLA. De plus, la ré-analyse de larges études de séquençage de patients a permis d’identifier des variants synonymes pour la protéine FUS, mais qui provoquent une mutation pour altFUS. L’expression de ces variants perturbe fortement le réseau mitochondrial, suggérant altFUS comme un nouvel acteur génétique à considérer en recherche et clinique.

Identification de nouveaux substrats qui interagissent avec l’exosite de la caspase-7


Marie-Anne Bilodeau-Laforest1, Alexandre Desroches2, Jean-Bernard Denault3
1Université de Sherbrooke 2Université de Sherbrooke 3Université de Sherbrooke

L'apoptose est un mécanisme crucial pour maintenir l'homéostasie des organismes multicellulaires. Les principaux acteurs de l'apoptose sont les caspases, une famille de cystéine peptidases qui sont également impliquées dans l'inflammation. Dans cette famille, nous trouvons les caspases initiatrices activées par un signal de mort et les caspases exécutrices activées par protéolyse par les initiatrices. Les deux caspases principales pour l’exécution de l’apoptose, la caspase-3 et -7, partagent une structure similaire et un ensemble de substrats qui se chevauchent en raison de la similarité de leurs séquences de reconnaissance de structure primaire. Ainsi, elles ont été considérées comme redondantes dans la cellule, la caspase-3 étant considérée comme l’actrice majeure en raison de son activité intrinsèque plus élevée. Notre laboratoire a démontré auparavant que la caspase-7 possède un exosite; c'est-à-dire une région indépendante de la poche catalytique qui lie les substrats et permet d’augmenter son affinité pour la peptidase, augmentant ainsi l'efficacité du clivage. L'exosite de la caspase-7 est composé de quatre résidus lysine (K38KKK) dans son domaine N-terminal (NTD) et favorise le clivage de PARP-1 et p23. Hypothèse : Nous proposons que le NTD de la caspase-7 agit comme un exosite pour plusieurs substrats clés clivés au cours de l'apoptose. Objectif : Nous allons identifier les protéines qui sont clivées par la caspase-7 d'une manière dépendante de l'exosite. Méthode : Nous avons modifié génétiquement la lignée cellulaire de carcinome colorectal HCT116 en utilisant une combinaison de CRISPR/Cas9 et de lentivirus pour exprimer la caspase-7 de type sauvage, un mutant de l’exosite et un mutant catalytique. L'apoptose a été induite dans ces cellules avec du 5-fluorouracile. Le protéome des cellules sera analysé par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) suivie d'une stratégie protéomique combinée SILAC/TAILS. Résultats : 1) Les cellules HCT116 reconstituées avec diverses formes moléculaires de la caspase-7 expriment des niveaux similaires de protéines par rapport aux cellules parentales; 2) L’induction de l’apoptose dans les différentes lignées cellulaires démontrent un clivage différentiel de PARP-1 validant l'exosite in cellulo dans nos cellules modifiées; et 3) les expériences MS/MS initiales ont démontré notre capacité à détecter les événements de clivage du substrat de la caspase. À ce stade, des expériences SILAC/TAILS MS/MS sont actuellement en cours. Conclusion : Nous pensons qu'avec cette stratégie, de nouveaux substrats, dont certains interagissant avec l'exosite, seront identifiés. Cette recherche mettra en évidence la spécialisation de la caspase-7 par rapport à la caspase plus généraliste; la caspase-3.

Identification de partenaires protéiques de TMPRSS6, une protéase impliquée dans l’homéostasie du fer et l’obésité


Sébastien Dion1,2, François Béliveau1,2, Antoine Désilets1,2, Richard Leduc1,2
1Département de pharmacologie-physiologie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke 2Institut de Pharmacologie de Sherbrooke, Université de Sherbrooke

TMPRSS6 (matriptase-2) est une protéase à sérine transmembranaire de type II principalement exprimée dans le foie. À la surface cellulaire des hépatocytes, TMPRSS6 clive l’hémojuvéline et régule négativement la production de l’hepcidine, l’hormone responsable de l’homéostasie du fer. TMPRSS6 est une cible thérapeutique d’intérêt pour les maladies associées à une surcharge en fer, telles l’hémochromatose héréditaire et la bêta-thalassémie. Elle serait également impliquée dans l’obésité par des mécanismes qui restent à élucider. Récemment, nous avons démontré que les isoformes de TMPRSS6 sont différentiellement exprimées et qu’elles possèdent des fonctionnalités distinctes. À ce jour, aucune fonction physiologique n’est d’ailleurs connue pour les isoformes 3 et 4 (TMPRSS6-3 et TMPRSS6-4), toutes deux catalytiquement inactives. Nous émettons l’hypothèse que TMPRSS6 interagit avec des partenaires protéiques non-identifiés à ce jour et que leur identification éclaircirait les rôles de TMPRSS6 dans l’homéostasie du fer et l’obésité. Afin d’identifier ces partenaires, des cellules de carcinome hépatocellulaire (Hep3B) ont été transfectées avec l’isoforme la plus exprimée de TMPRSS6 (isoforme 2) de type sauvage (WT) et un mutant catalytiquement inactif (S762A). Des préparations de membranes ont été réalisées avant immunoprécipitation (IP) et identification de partenaires protéiques par spectrométrie de masse. Les protéines enrichies dans les IP de TMPRSS6-2 WT et S762A ont été comparées avec celles identifiées dans des cellules transfectées avec le vecteur vide pour déterminer leur facteur d’enrichissement (FE) en utilisant le logiciel CRAPome. En établissant un FE ³ 3, 95 partenaires ont été identifiés pour TMPRSS6-2 WT et 165 pour TMPRSS6-2 S762A, dont 72 sont communs aux deux conditions. Les interactomes des partenaires ont été élaborés avec STRING.  Dans les deux cas, le récepteur à la transferrine 1 (TFRC), impliqué dans la régulation du fer, a été identifié comme partenaire et est la seule protéine ayant un lien prédit par STRING entre TMPRSS6 et le reste de l’interactome. Parmi les enrichissements fonctionnels prédits par STRING (KEGG Pathways) pour TMPRSS6-2 WT et S762A, plusieurs des nouveaux partenaires sont impliqués dans des processus métaboliques, dont ACACA, une carboxylase responsable de la biogénèse des acides gras. Les différences importantes entre les protéines enrichies (FE ³ 3) pour TMPRSS6 WT (23 protéines exclusives) et S762A (93 protéines exclusives), indiquent que l’activité catalytique influence grandement les interactomes obtenus à la suite des immunoprécipitations. Des protéines impliquées dans le métabolisme, telles que MTOR et EGFR, ont été enrichies exclusivement en présence du mutant inactif S762A alors que les protéines P4HB et ACLY ont un FE ³ 3 seulement en présence de l’enzyme active. À présent, nous souhaitons éclaircir le rôle que joue TMPRSS6 en validant certaines interactions clés par co-IP, immunobuvardage et microscopie. De plus, nous souhaitons procéder semblablement pour identifier des partenaires spécifiques aux isoformes 3 et 4 de TMPRSS6. Finalement, l’identification de nouveaux partenaires de TMPRSS6 et l’éclaircissement des fonctions de l’enzyme et de ses isoformes permettra potentiellement la positionner comme cible thérapeutique pour d’autres pathologies, dont l’obésité et les troubles métaboliques.

Identification d’Ubiquitine Ligases Impliquées dans la Protection du Génome Humain


Billel Djerir1, Théo Morin1, Daniel Garneau1, Isabelle Marois1, Alexandre Maréchal1
1Université de Sherbrooke

Nos cellules sont continuellement exposées à des sources endogènes et exogènes de dommages à l'ADN qui menacent l’intégrité de leur génome. Néanmoins, les cellules résistent à ces perturbations en actionnant un réseau complexe de protéines qui détectent, signalent et réparent les lésions génomiques. La coordination des différents facteurs recrutés aux sites de dommages est contrôlée par des modifications post-traductionnelles. L’ubiquitination en particulier permet de modifier le niveau et/ou l’activité des protéines de maintien du génome afin de réguler leur fonction. Dans les cellules humaines, l’ubiquitination est effectuée par > 600 ubiquitines ligases qui ciblent chacune un ensemble de substrats spécifiques. L’implication de ces ubiquitine ligases dans la protection du génome et les substrats qu’elles modifient sont encore peu caractérisés. Dans le cadre de cette étude, un criblage systématique des ubiquitine ligases nucléaires humaines a été effectué afin d’identifier celles impliquées dans le maintien de la stabilité du génome. Par une approche bio-informatique, nous avons construit une librairie lentivirale permettant l’expression de 187 ubiquitine ligases fusionnées à un épitope FLAG. Nous avons examiné leur recrutement aux sites de bris dans l’ADN induits par micro-irradiation au laser. Afin de confirmer l’implication des ligases recrutées aux sites de dommages dans la protection du génome, une librairie de siRNAs est utilisée pour réaliser des essais de viabilité en présence d’agents génotoxiques. Nos travaux permettront d’identifier de nouveaux facteurs importants pour la réparation de l’ADN et mèneront à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires responsables de la stabilité du génome.

Identification of structural determinants of biased signaling of the apelin receptor


Laurent Bruneau Cossette1, Xavier Sainsily1, Mannix Auger-Messier1, Philippe Sarret1, Éric Marsault1, Pierre Lavigne1
1Université de Sherbrooke

G protein-coupled receptors (GPCRs) are transmembrane proteins responsible for the conversion of extracellular signals into intracellular signals, a process called signal transduction. They do so upon binding of an extracellular compound - the ligand - by coupling with and activating intracellular effector proteins, G proteins and arrestins being the main ones. A phenomenon knows as biased signaling - that is, the ability of the GPCR to couple preferentially with either of its effector proteins - is currently under investigation by both academia and industry for its potential to limit or prevent side effect of pharmaceutical compounds that target GPCRs. Although a lot of experimental data is now available on this phenomenon and what structural components of the protein are involved in the process of GPCR signaling, the dynamic processes by which these structural components enable the binding of effector proteins remain poorly understood. The apelin receptor (APJ) is a receptor involved in various cardiovascular processes, the most interesting being vasodilation and cardioprotection for their application to heart failure and hypertension. Because it has been relatively not much studied, little is known about whether it is possible to produce targeted effects (e.g. cardioprotection without vasodilation) because little is known on its ability to produce signaling that is biased towards effector proteins other than Gi.

In a bid to understand the dynamic processes involved in APJ biased signaling, a two-pronged approach, using molecular dynamics for structural data and Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) on several APJ mutants for signaling data, has been used. Molecular systems containing APJ with apelin-13 - one of its ligands - and APJ without apelin-13, stemming from an X-ray structure of an active-like APJ with a peptidic macrocyclic agonist (Ma Y et al. 2017), were simulated using Gromacs (GROMOS 54a7 forcefield) over 10-16 µs. By using the combination of a time-lagged Independent Component Analysys (tICA) and a Hidden Markov Model (HMM) for simulation analysis, it has been found that two structural rearrangements could constitute early activation events: a diminution of the angle between transmembrane domains (TM) 3 and 6, likely caused by residues W261 (6.48) and F257 (6.44), as well as the formation of a kink in TM7 around the NPxxY motif. Using simulation data on which residues and structural regions are involved, as well as data from existing literature, a set of 23 APJ mutants was created and analyzed for apelin-13 binding, cell surface expression and signaling for both Gi and beta-arrestin-2 pathways using BRET. Mutant N112G was identified as constitutively active on both Gi and beta-arrestin-2 pathways, and mutants D126V and V254L were identified as constitutively active only for the Gi pathway. Several other mutants also exhibited various degrees of constitutive activity, but were redundant in behaviour and were thus excluded from further study. Subsequent simulations on N112G molecular systems equivalent to those of WT APJ confirm that both structural rearrangements that were observed in WT simulations also occur in N112G APJ, this time with or without apelin. More data is currently required for D126V and V254L to obtain accurate information on their simulation data. This study provides tremendous insight on the dynamics of APJ signaling, is consistent with existing structural data on other GPCRs and led to the discovery of one mutant with apparently indiscriminate constitutive activity, and two mutants with a Gi-exclusive constitutive activity. These mutants can be used for further studies on the signaling properties of both APJ and its various ligands to better understand their behavior.

La caspase-7 interagit avec plusieurs domaines de PARP-1


Alexandre Desroches1, Éric Marsault1, Jean-Bernard Denault1
1Université de Sherbrooke

INTRODUCTION:  Les caspases sont des protéases à cystéine qui, par le clivage de nombreux substrats clés, sont impliquées dans l’apoptose et l’inflammation. Un de ces substrats clés est PARP-1, une enzyme impliquée entre autres dans la détection de bris à l'ADN. Bien que PARP-1 soit clivée à la fois par la caspase-3 et la caspase-7, c'est cette dernière qui est la plus efficace et ce malgré son activité intrinsèque plus faible. Nous avons découvert que la caspase-7 possède un exosite dans son domaine N-terminal qui interagit avec PARP-1. Un exosite est un domaine d'interaction avec le substrat qui se trouve en dehors de la pochette catalytique et qui a pour effet d'augmenter l'efficacité d’une enzyme. Malgré cette découverte, les déterminants de cette interaction exosite-substrat sont encore méconnus.

 

MÉTHODES:  Afin de caractériser l’interaction entre la caspase-7 et PARP-1, des mutants de délétion de PARP-1 ont premièrement été générés. Les mutants ont ensuite été testés dans des essais de clivage afin d'identifier le ou les domaines de PARP-1 qui interagissent avec l'exosite. L’efficacité de clivage de la caspase-7 sur les deux formes de PARP-1 (automodifiée ou non) a également été testée. Finalement, différentes conformations de PARP-1 on été induites puis leurs effets sur l'efficacité de clivage de la caspase-7 ont été évalués.

 

RÉSULTATS:  Les essais de clivages sur les mutants de délétion de PARP-1 nous ont permis d’identifier les domaines Zn3 et BRCT comme étant ceux qui interagissent avec l’exosite. Ensuite, les essais d'automodifications de PARP-1 ont démontrés que la forme non-modifiée est préférentiellement clivée par la caspase-7. Finalement, les essais de changements de conformations de PARP-1 nous ont permis de conclure que la caspase-7 interagit préférentiellement avec la forme libre de PARP-1, soit celle qui n'est pas liée aux différents bris d'ADN.

 

CONCLUSION:  En somme, nos travaux permettent de mieux comprendre comment les caspases reconnaissent et interagissent avec leurs substrats. De plus, puisque peu d'exosites ont été identifiés, nos études permettent de mettre en évidence l'importance de ces domaines d'interactions dans la sélection de substrats par les protéases.

La vitamine C oxydée catalyse la glutathionylation et l'homocystéinylation de la Glutaredoxine-1


Ahuié Grace Kouakou1, klaus klarskov2
1Université de Sherbrooke 2dep pharmacologie et physiologie

Le Stress oxydatif est un état de déséquilibre entre les oxydants ainsi que les antioxydants. Afin de se protéger contre les effets délétères de ces espèces réactives, l’organisme utilise soit des antioxydants exogènes ou endogènes qui s’oxydent dans l’exercice de leur fonction de réducteur. Ainsi, la vitamine C ou acide ascorbique, vitamine essentielle, peut céder distinctement deux électrons pour devenir semi-dehydroascorbate( SDA) puis dehydroascorbate DHA (1) et le Glutathion, le thiol le plus abondant fabriqué par les cellules s’oxyde en glutathion dimère (GSSG).  Malgré ces défenses, l’organisme peut être submergé sous l’effet de la pression oxydative, et ce par l’action d’inducteurs du stress oxydatif tel que l’Homocystéine. L’Homocystéine (Hcy) est en fait un acide aminé non protéinogénique dont le taux sanguin élevé a été associé à plusieurs troubles cardiovasculaires et neurologiques.(2)

Le stress oxydatif, entraîne une oxydation simultanée de thiols de certaines protéines et la S-thiolation. Lorsqu'un thiol de protéine est modifié par le glutathion ou l’Homocystéine, on parle respectivement de S-Glutathionylation et S-Homocystéinylation. Plusieurs études reportent la glutathionylation réversible de protéines induites par le peroxyde d’Hydrogène (3) un puissant oxydant ayant des effets apoptotiques. Cependant, à notre connaissance, aucun article ne fait mention de la Glutathionylation induite par le DHA. Quant à l’homocystéinylation, elle est a  été jusque là jugée irréversible et les études publiées ne s’intéressent qu’à son impact sur le stress oxydatif (4) et non l’effet du stress oxydatif sur cette modification.

Nous avons donc investigué l’effet du DHA sur la glutathionylation et l’Homocytéinylation protéique. En utilisant la spectrométrie de masse, nos études ont permis de démontrer que le DHA induit l’Homocystéinylation de la Grx1, une oxydoréductase impliquée dans le recyclage de la vitamine C. Des études de comparaisons entre ces deux modifications ont permis de déterminer la modification la plus rapide. Enfin, nous avons démontré que contrairement aux connaissances actuelles, l’Homocystéinylation peut être déplacé sous l’effet du glutathion dimère

 

Macrocycle as tool to modulate the in vivo stability and agonistic properties of pyr-apelin-13 peptide


Kien Tran1, Alexandre Murza1, Sainsily Xavier1, Jérôme Côté1, karine Belleville1, David Coquerel1, Lounès Haroune1, Jean-Michel Longpré1, Oliver Lesur1, Philippe Sarret1, Éric Marsault1
1Université de Sherbrooke

Macrocycle is an emerging chemical class to address challenging targets such as protein-protein interactions, GPCRs. Here, we reported an example when macrocyclization improves the in vivo stability and modulates agonistic properties of pyr-apelin-13 peptide, the ligand of APJ receptor (GPCR class A) with powerful action on the cardiovascular system.

First, macrocycle has been implemented on every position of pyr-apelin-13 by introducing two allylglycines followed with ring closing metathesis. By comparing the cyclic analogues with their linear counterparts, several positions at C-term showed favourable results for macrocyclization when the affinity on APJ receptor of cyclic compounds is comparable or even 5-7 folds superior after optimization. Regarding pharmacokinetic properties, the half-lives and cleavage sites of all macrocyclic analogues in rat plasma have been determined, showing a dramatically improvement of plasma stability (t1/2 > 8 h vs 24 min of pyr-apelin-13) which translated to an increase of their in vivo exposure (t1/2 20 min). In term of agonistic profile, Gαi activation and β-arrestins recruitment pathway have been examined which led to the discovery of compound selectively deprivating β-arrestin pathway. This result was agreed with APJ internalization assay and in vivo in blood pressure test when the peptide is 10-fold less potent than pyr-apelin-13 to induce receptor sequestration and showed a reduced hypotensive potency. Although its hypotensive action, which could be an undesirable effect, is reduced, the cardiac activities is significantly improved when the peptide manifested maximum inotropic efficacy at 3 pM vs 30 pM of apelin-13.

In conclusion, our study demonstrated the advantage of macrocyclization approach for pyr-apelin-13 when using it to protect the peptide against proteolytic degradation, improve in vivo stability and modulate significantly its affinity, signalling profile as well as the physiological activities.

Modes d'intéraction non canoniques entre le récepteur met et l'isoforme p66 de la proteine shc et sa dualité fonctionnelle


Jesús Gerardo Contreras Ojeda1, Stephen McManus1, Mélissa Landry1, Véronique Pomerleau1, Caroline Saucier2
1Université de Sherbrooke 2Université de Sherbrooke

Le récepteur MET se lie aux trois isoformes des protéines adaptatrices codées par le gène SHCA. L'isoforme p52SHC couple le récepteur tyrosine kinase (RTK) MET à l'activation de la voie mitogénique RAS/MAPK ainsi qu’à la voie de survie PI3K. Ceci implique la phosphorylation de p52SHC sur des résidus tyrosine (Tyr) qui forment des sites de liaison pour le domaine SH2 de la protéine adaptatrice GRB2 ; ce qui mène à la liaison du facteur d'échange guanylique de RAS SOS1 et de la protéine d'échafaudage GAB1. En revanche, p66SHC évoque une inhibition de la voie MAPK, et l'apoptose suite à un stress oxydatif ainsi qu’à l’atteint de la confluence dans les cellules adhérentes, mais cause aussi une résistance à l'anoïkose. De plus, alors que la liaison de p52SHC aux complexes MET et GRB2/GAB1 est dépendante de l'activité MET, p66SHC interagit constitutivement avec ces protéines d'une manière pTyr-indépendante.

 

Nous proposons l’hypothèse que l'état d'activation des RTK définit la nature des complexes protéiques qui interagissent avec p66SHC, et que ses derniers sont sous-jacents à sa dualité de fonction biologique. Pour vérifier nos hypothèses, nous identifierons l'interactome de p66SHC selon l'état d'activation de MET en par une approche protéomique basée sur l’identification par biotinylation de proximité (BioID) et la spectrométrie de masse (SM).  En bref, la protéine de fusion biotine ligase-p66SHC sera exprimée avec TPR-MET, une forme constitutivement activée du RTK MET, ou un mutant ayant un domaine kinase non-fonctionnelle. Par des analyses de l'ontologie génique des principaux candidats de liaison avec p66SHC déterminés par BioID, nous obtiendrons un aperçu de leur mode d'interaction et de leur rôle dans les processus biologiques de p66SHC et de MET. Pour les liants de p66SHC pertinents et validés, leurs rôles seront définis par des études de gain et de perte de fonction.

 

Notre étude pourrait fournir une compréhension nouvelle de la régulation dynamique dépendante de l'état d'activation RTK de l'interactome de p66SHC dans des cellules ainsi que de découvrir les mécanismes sous-jacents à sa double fonction cellulaire contextuelle.

 

OpenProt unveils yet unseen depth of proteomes


Sebastien Leblanc1, Sondos Samandi2, Marie Brunet2, Jean-François Lucier2, Mylène Brunelle2, Xavier Roucou2
1Bishop's University 2Université de Sherbrooke

The structure of gene transcripts has traditionally been described as organized by one protein coding region (CDS), encoding a canonical or reference protein, flanked by two untranslated regions (UTRs). Hence, eukaryotic genes are believed to code for one reference protein and its splicing derived isoforms. However, recent studies showing the expression and function of proteins from alternative coding sequences force us to reconsider this general architecture. Alternative open reading frames (altORFs) are found upstream and downstream of the canonical CDS as well as overlapping it in a shifted frame, or in transcripts annotated as non-coding. Thus, eukaryotic genes might be polycistronic genes after all. Here we present a new method of transcript annotation which incorporates this higher coding potential to attain a more comprehensive description of stored proteomic information. Following a systematic approach, genome wide in-silico translation where currently known proteins, called reference proteins, are annotated alongside their isoforms and alternative proteins (altProts) who result from altORFs.

These predictions are evaluated using high throughput search of proteomics and conservation data to identify expressed alternative proteins. More targeted investigations are enabled by the availability of such a framework, enforcing experiment-driven annotation as well as conservation- and hypothesis-driven ones.These novel functional annotations are displayed within a web-based platform termed OpenProt (www.openprot.org). We used OpenProt to reprocess large-scale affinity purification mass spectrometry data of human reference proteins. We identified with high confidence 188 alternative proteins in the interactome of 606 reference proteins. Integration of this interactome information will yield insight on the role that these alternative proteins play in cellular processes. For example, UbKEKS is a newly discovered protein encoded in a pseudogene of ubiquitin B which was discovered while analysing such protein-protein interaction networks. With the hopes of igniting further discovery and to assist in proteomics research endeavors, the data are made publicly available at www.OpenProt.org.

Optimisation de l’activité et de la sélectivité d’agonistes des récepteurs neurotensinergiques


Michael Desgagné1, Marc Sousbie1, Philippe Sarret1, Éric Marsault1
1Université de Sherbrooke 2Université de Sherbrooke

La neurotensine est un neuropeptide. C'est le ligand endogène de deux membres de la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs NTS1 et NTS2. L'activation de ces récepteurs par ce ligand est connue pour provoquer un puissant effet analgésique. Le système neurotensinergique est donc une cible de choix pour le développement des composés analgésiques. Afin d'explorer et faire avancer les connaissances de relations structure-activité entre la neurotensine et ses récepteurs, nous avons utilisé une approche de conception rationnelle d'analogues du ligand endogène. En nous basant sur les informations disponibles dans la littérature scientifique, nous avons macrocyclisé ce peptide afin de contraindre sa conformation. Nous avons aussi évalué l'effet de la macrocyclisation sur la stabilité des analogues ainsi produits. La première étape a consisté à trouver une manière de macrocycliser qui favorise la liaison au récepteur. Ceci a été accompli après de nombreux essais infructueux et a été facilité par la structure cristallographique du récepteur NTS1. L'étape suivant a consisté à optimiser le macrocycle obtenu, tant au niveau de la liaison/activation du récepteur qu'au niveau de la résistance aux protéases. Deux macrocycles ont ainsi été sélectionnés pour être caractérisés dans des essais in vivo, l'un avec la meilleure affinité et une stabilité modérée, l'autre avec une excellente stabilité mais une affinité modérée. Ceux-ci ont démontré leur capacité à induire un puissant effet analgésique dans deux modèles de douleur. Enfin, la dernière étape a été d'explorer comment des macrocycles sélectifs envers NTS2 peuvent être obtenus dans le but de produire des composés présentant des moins d'effets indésirables.

Optimisation d’inhibiteurs de la matriptase-2


Méryl-Farelle Oye mintsa mi-mba1,2, Pierre-Luc Boudreault1,2, Antoine Désilets1,2, Richard Leduc1,2, Éric Marsault1,2
1Université de Sherbrooke 2IPS - Université de Sherbrooke

La matriptase 2 (MAT-2) est une enzyme de la classe des protéases à sérine transmembranaires de type II, située à la surface des hépatocytes. Elle est constituée d’un domaine N-terminal localisé dans le cytoplasme suivi d’un domaine transmembranaire, de plusieurs domaines de reconnaissance (SEA, CUB et LDLA) ainsi qu’un domaine C-terminal où l’on retrouve le domaine catalytique (incluant la triade histidine, aspartate, sérine). Plusieurs études ont montré que la MAT-2 agit comme un régulateur de l’homéostasie du fer : elle régule négativement les niveaux d’hepcidine en clivant l’hémojuvéline ce qui favorise le relargage de fer emmagasiné dans les cellules vers la circulation. L’inhibition de cette enzyme ouvre la voie vers le traitement de maladies reliées à une surcharge en fer telles que la bêta-thalassemie et l’hémochromatose juvénile. Notre laboratoire a précédemment conçu et synthétisé des inhibiteurs de la MAT-2 de type peptidomimétiques. L’objectif principal de ce projet est d’optimiser ces composés pour améliorer leur puissance d’inhibition et leur sélectivité envers MAT-2.

 

La conception des différents inhibiteurs se fait par modélisation moléculaire basée sur les structures des pochettes catalytiques des protéases qui sont visualisées à l’aide du logiciel MOE. Les composés sont constitués d’une courte séquence d’acides aminés suivie d’un groupement réactif (warhead) permettant l’inhibiton de l’enzyme. Ces peptides sont synthétisés en deux temps : les tripeptides seront synthétisés sur phase solide, tandis que le Warhead sera synthétisé en phase liquide. S’en suit alors la synthèse du tétrapeptide en phase liquide. Afin de caractériser l’interaction enzyme/inhibiteur, la détermination de la constante de dissociation (Ki) est effectuée à l’aide d’un substrat fluorogénique.

 

Nous nous sommes servis de la structure 3D de la matriptase (MAT) obtenue par diffraction des rayons X du cristal ; à laquelle nous avons superposé une structure 3D de MAT-2 (obtenue par homologie de structure de la MAT). Chaque position a été étudiée afin de déterminer les similarités et les différences entre les positions des deux protéases. Les différences les plus importantes sont définies telles que : en S2, une His (MAT-2) vs une Phe (MAT) ; Glu (MAT-2) vs Tyr (MAT) ; Gln (MAT-2) vs Ile (MAT), favorisent la présence d’une base ou des donneurs/accepteurs de protons en P2 de l’inhibiteur. En P3 des petits résidus aromatiques riches en électrons augmentent la sélectivité pour MAT-2. En P4, les résidus portant une amine sont dégradés par les exopeptidases du plasma, de fait seuls les composés désamino ont été considérés pour cette position ; composés possédant un résidu aromatique pauvre en électron.

 

Les résultats obtenus par modélisation ont permis la conception d’une librairie de composés au potentiel inhibiteur qui sera synthétisée et testée en essais biologiques afin de valider les hypothèses d’arrimage moléculaire.

Régulation de la stabilité du génome par les E3 ubiquitine ligases PRP19 et RFWD3


Maïlyn Yates1, Antoine Gaudreau-Lapierre1, Pauline Kackzmarek1, Théo Morin1, Alexandre Maréchal1
1Université de Sherbrooke

Le stress réplicatif est une source endogène majeure de stress génotoxique pouvant causer des mutations et des réarrangements dans l’ADN. L’accumulation d’erreurs durant la réplication de l’ADN est à la base du développement de pathologies telles que le cancer. Afin d’éviter le dérèglement de leur programme génétique, les cellules possèdent des mécanismes complexes de réponse aux dommages à l’ADN. La mise en place de cette réponse est médiée par la protéine de réplication A (RPA), qui reconnaît et recouvre simultanément la portion d’ADN simple brin (ADNsb) généré lors du blocage de la fourche de réplication. Ce recrutement de RPA permet de former la plateforme RPA-ADNsb essentielle à la signalisation, au recrutement et à l’activation de protéines cruciales pour la protection du génome. Ces différentes étapes de la réponse sont régulées par de nombreuses modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, l’ubiquitination, la sumoylation et l’acétylation.

 

Nous avons démontré que les E3 ubiquitines ligases PRP19 et RFWD3 ubiquitinent RPA pour favoriser la réparation de l’ADN. L’ubiquitination étant une modification post-traductionnelle régulant plusieurs niveaux de la réponse aux dommages à l’ADN, notre hypothèse est que PRP19 et RFWD3 ubiquitinent différentes protéines sur la plateforme RPA-ADNsb pour conduire au redémarrage des fourches de réplication.

 

En effectuant des analyses protéomiques de PRP19 et de ses interacteurs par spectrométrie de masse, nous avons identifié l’ATPase SWI/SNF2 SMARCAL1 comme un nouveau partenaire de PRP19. Connue comme une enzyme possédant un domaine de liaison à RPA jouant un rôle crucial dans la réversion et le redémarrage des fourches de réplication, nous avons déterminé que la fonction de SMARCAL1 dans la réponse au stress réplicatif est régulée par son ubiquitination.

 

Nous avons confirmé par microscopie confocale après microirradiation au laser UV la co-localisation de PRP19 et de RFWD3 avec SMARCAL1 aux sites de dommages sur la plateforme RPA-ADNsb. Nous avons ensuite montré par des essais d’ubiquitination in vivo que SMARCAL1 est ubiquitiné par PRP19 et RFWD3 en réponse au stress réplicatif. L’ubiquitination est une modification complexe pouvant mener à différentes conséquences pour la protéine. Nous avons exclu que l’ubiquitination de SMARCAL1 conduit à sa dégradation par le protéasome. La suite de nos travaux vise à déterminer l’importance fonctionnelle de l’ubiquitination de SMARCAL1 par PRP19 et RFWD3 dans le redémarrage des fourches de réplication. Une meilleure compréhension du mécanisme de réparation des dommages en réponse au stress réplicatif permettrait l’identification de cibles potentielles pour la sensibilisation des cellules cancéreuses aux traitements chimiothérapeutiques.

Structural and dynamic characterization of UbKEKS, a newly identified ubiquitin encoded in a pseudogene


Patrick Delattre1, Marie-Line Dubois1, François-Michel Boisvert1, Xavier Roucou2, Pierre Lavigne3
1Université de Sherbrooke 2Université de Sherbrooke 3Unibersité de Sherbrooke

The research team of Pr. Xavier Roucou developed a new database which considers the non-coding regions of the genome. This new database led to the discovery of multiple new proteins from overlooked regions, namely 5’ & 3’ UTR, alternate reading frames, and pseudogenes. This new database, coupled with the re-analysis of high through-put mass spectrometry, led to the discovery of UbKEKS, a ubiquitin isoform encoded in the pseudogene UBBP4. Until now, only one ubiquitin was known and expressed in every cellular type.

Ubiquitin is a 76 amino acid protein use as a post-translational modification by covalently linking the c-terminal glycine to the amine group of a lysine. This protein serves as a signal in a variety of cellular pathways, notably the TGFβ, MAP kinase and degradation pathway. The regulation of these pathways being affected in most cancers, their study is of the utmost importance.

Preliminary results suggest that this new ubiquitin act as a post-translational modification but doesn’t interact with the proteasome as opposed to its canonical counterpart.

In this study, we will investigate the structural and dynamic properties of this newly identified ubiquitin and eventually characterize its interaction with different ubiquitin binding domains.

Structure determination of disease associated peak AAA from L-Tryptophan implicated in the eosinophilia-myalgia syndrome (EMS)


Chad Normandin1, Hugo Gagnon2, Baptiste Plancq1, Gerald J. Gleich3, Stephen Naylor4, Pierre-Luc Boudreault1, Eric Marsault1, Klaus Klarskov1
1Université de Sherbrooke 2PhenoSwitch Bioscience 3University of Utah 4ReNeuroGen LLC

The eosinophilia-myalgia syndrome (EMS) outbreak of 1989 that caused at least 37 deaths and over 1500 cases occurred in the USA and elsewhere. The outbreak was caused by the ingestion of L-Tryptophan (L-Trp) supplements manufactured by the Japanese company Showa Denko (SD). The company genetically engineered a Baccilius sp bacterium to produce L-Trp more efficiently. Among sixty impurities present in the SD L-Trp, six were reported to be case-associated contaminants. One of these compounds, Peak AAA, has remained structurally uncharacterized, despite the fact that it was described as ‘’the only statistically significant (p=0.0014) contaminant’’. Capillary-high performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry (LC-MS) and tandem mass-spectrometry (MS/MS) were used to determine that Peak AAA was in fact two structurally related isomers. Peak AAA1 and Peak AAA2 differed in LC retention times, and were shown by accurate LC-MS to have a protonated molecular ion (MH+) mass of 343.239 Da, corresponding to a molecular formula of C21H30N2O2, possessing eight degrees of unsaturation for the non-protonated molecules. By comparing the LC-MS and LC-MS-MS retention times and spectra with the authentic synthetic standards, Peak AAA1 was identified as the intermolecular condensation of L-Trp with (S)-anteiso 7-methylnonanoic acid, to afford (S)-2-amino-3-(2-((S,E)-7-methylnon-1-en-1-yl)-1H-indol-3-yl)propanoic acid. Peak AAA2 was determined to be the condensation of L-Trp with decanoic acid, which produced (S)-2-amino-3-(2-((E)-dec-1-en-1-yl)-1H-indol-3-yl)propanoic acid4. In this presentation, we will present the analytical results that led to the proposed structure as well as the synthetic optimization and synthesis of several analogues that led to the proof of identity of Peak AAA

J. Am. Med. Ass. 1990, 11, 213-7.

 Chem. Pharm. Bull. 1991, 39, 820-2.

Arch. Env. Cont. & tox. 1993, 25, 134-142

Tox. Lett. 2018, 282, 71-80

Validation de l’implication de Gq/11 dans l’activation du canal TRPC6 par AT1R à l’aide d’un biosenseur BRET


Audrey Collette1, Élie Besserer-Offroy2, Brian Holleran3, Guylain Boulay4, Richard Leduc5
1Université de Sherbrooke 2Université de Sherbrooke 3Université de Sherbrooke 4Université de Sherbrooke 5Université de Sherbrooke

Le récepteur à l’angiotensine II de type 1 (AT1R) est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) impliqué dans la libération intracellulaire de Ca++ par son couplage à la protéine Gαq menant à la production d’IP3 et son interaction avec certains canaux Transient receptor potential canonical (TRPC). Il a été démontré qu’il est possible de détecter l’activation de TRPC3 en créant un biosenseur Bioluminescence Resonance Energy Transfert (BRET). Nous avons donc émis l’hypothèse qu’il est possible de créer un biosenseur BRET pour observer l’activation du canal TRPC6.  Pour ce faire, nous avons construit le biosenseur GFP10-TRPC6-RLucII. Des cellules HEK293 co-transfectées avec le biosenseur et le AT1R ont été stimulées avec l’angiotensine II (AngII) et le ratio BRET a été mesuré. Une variation du ratio BRET dose-dépendante se maintenant dans le temps a été observée. Nous avons aussi déterminé que le ratio BRET obtenu comportait une composante inter et intramoléculaire. De plus, nous avons observé que le biosenseur peut être activé par différents RCPG couplés à Gαq en le co-transfectant avec une variété de RCPG.  Finalement, nous avons déterminé que le ratio BRET obtenu était dépendant de l’activation de Gαq, puisque suite à un prétraitement avec un inhibiteur de la protéine Gq/11, on ne retrouve plus de variation du signal BRET. Ce biosenseur se veut être un outil afin de mieux comprendre l’activation des canaux TRPC.

Vers le développement d’une nouvelle génération d’inhibiteurs de l’oncoprotéine c-Myc


Jean-Michel Moreau1, Danny Létourneau1, Martin Montagne1, Pierre Lavigne1
1Université de Sherbrooke

Dans plus de 70% des cancers, l’oncoprotéine c-Myc se retrouve dérégulée. En temps normal, c-Myc persiste dans la cellule environ 30 minutes avant d’être envoyée au protéasome. Cependant, de nombreuses voies de signalisation impliquées dans le cancer (e.g. EGF) causent une accumulation de c-Myc dans la cellule en l’empêchant d’être dégradée – résultant alors en une prolifération augmentée et une addiction de la cellule à c-Myc. Une réduction des taux de c-Myc dans les cellules cancéreuses induit l’apoptose – il serait donc intéressant de se pencher sur une stratégie d’inhibition directe de c-Myc plutôt que de cibler ses effecteurs comme plusieurs groupes de recherche tentent de faire. Cependant, c-Myc est une protéine intrinsèquement désordonnée, rendant la tâche de la cibler directement plus ardue, par son incapacité à adopter par elle-même une structure 3D stable.

 

L’objectif du projet est d’identifier et caractériser la  structure d’une conformation stable et inactive du b-HLH-LZ – le domaine de liaison à l’ADN – de l’oncoprotéine c-Myc. Pour ce faire, nous avons étudié l’interaction entre le b-HLH-LZ de c-Myc et une région d’interaction connue sur la protéine à doigts de zinc Miz-1, la région Mid2 (c-Myc interacting domain). L’information structurale issue de ce complexe servira à développer des inhibiteurs sous forme de petites molécules qui auront une fonction inhibitrice directe de c-Myc, sans avoir à passer par son partenaire ‘’obligatoire’’ Max. 

 

L’information structurale de l’interaction avec b-HLH-LZ de c-Myc a été obtenue par résonance magnétique nucléaire et dichroïsme circulaire. Des spectres 15N-1H HSQC ont été réalisés sur c-Myc∘ en présence de différentes parties de la région Mid2 de Miz-1, en plus de contrôles avec des molécules inhibitrices de c-Myc∘ commerciales: 10058-F4 et 10074-G5.​