Bio-impression d’un dôme d'hydrogel sphérique contenant des cellules de mélanome uvéal pour tester la fonctionnalité d’implants de curiethérapie
Philippe Gros-Louis
Bio-impression d’un modèle in vivo représentant un œil humain
Sophie Lemay
Cancer de la vessie et bisphénols : les liaisons dangereuses.
Felix-Antoine Pellerin1
Caractérisation des vésicules extracellulaires sécrétées par les cellules du mélanome uvéal et de leur internalisation dans les cellules stellaires hépatiques
Nathan Schoonjans
Complications évolutives associées au traitement chirurgical des prolapsus génitaux
Yuling Wu
Conservation du membre inférieur gauche plutôt que l’amputation
Tianyi Zhou
Corrélation in vitro du profil psoriasique de peaux reconstruites en fonction du score PASI des patients
Maxime Kusik
Effet des milieux conditionnés par les cellules stromales sur la prolifération et la migration des cellules urothéliales
Tarek Omaiche
Effets de l’inhibition de la capture d’exosomes dérivés de cancer de la vessie sur la progression tumorale.
Emil Grammond
Encapsulation de médicaments par des nanoparticules d’or pour la thérapie oculaire
Gabrielle Raîche-Marcoux
Étude d'imprimabilité d'implants de curiethérapie pour l'oeil en polyétheréthercétone.
Jonathan Lévesque
Incidence du traitement et des propriétés des cornées cadavériques sur la qualité des cellules endothéliales cornéennes en culture
Antoine Blaquière
Interactions membranaires des protéines S100A1 et S100B.
Paul Jaouen
Le rôle des microtubules dans la distribution de la transglutaminase 1 lors de la différenciation des kératinocytes.
Emilie Doucet
Les bisphénols pourraient-ils jouer un rôle dans l’initiation et la progression du cancer de la vessie?
Ève Pellerin
Modification and Characterization of Fluoropolymers treated by Low Pressure Plasma
Alexandre Holmes
Optimisation du protocole de purification de la lécithine rétinol acyltransférase tronquée
Jordan Grondin
Protection des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien contre la mort induite par un stress oxydatif
Julie Bérubé
Prothèses intraosseuses percutannées : Etapes de développement et mise sur le marché d’un nouveau produit
Mathilde MASSONIE
Surexpression et purification des formes non-acylée et acylée de la rhodopsine kinase
Benoît Labrecque
TEST DE DÉCOLLEMENT POUR MESURER LA FORCE D’ADHÉSION DE LA JONCTION DERMO-ÉPIDERMIQUE D’UN MODÈLE DE PEAU RECONSTRUITE PAR GÉNIE TISSULAIRE
Alex Larose
The role and effect of exosomes in corneal wound healing
Elodie Gillard
VERS UN TRAITEMENT PERMANENT DE L’ÉPIDERMOLYSE BULLEUSE DYSTROPHIQUE RÉCESSIVE PAR COMBINAISON ENTRE LA THÉRAPIE GÉNIQUE ET LE GÉNIE TISSULAIRE
Anabelle Demers1

Bio-impression d’un dôme d'hydrogel sphérique contenant des cellules de mélanome uvéal pour tester la fonctionnalité d’implants de curiethérapie


Philippe Gros-Louis1,2,3,4, Sophie Lemay1,5,6, Julie Bérubé1,3,4, Claudine Bellerive2, Marc-André Fortin1,5,6, Solange Landreville1,2,3,4
1Centre de Recherche du Centre Hospitalier Universitaire de Québec-UL, Axe Médecine régénératrice, Québec, Qc, Canada 2Département d'ophtalmologie et d’ORL-CCF, Faculté de médecine, Université Laval, Québec, Canada 3Centre de recherche en organogénèse expérimentale de l’Université Laval/LOEX, Québec, Canada 4Centre de recherche sur le cancer de l’Université Laval, Québec, Canada 5Département de génie des mines, de la métallurgie et des matériaux, Université Laval, Québec, Qc, Canada 6Centre de recherche sur les matériaux avancés (CERMA), Université Laval, Québec, Qc, Canada

CONTEXTE ET OBJECTIFS: Environ 95% des mélanomes oculaires apparaissent dans le tractus uvéal (i.e. iris, corps ciliaire, choroïde). Il est possible de traiter ce type de tumeurs avec une plaque de curiethérapie déposée sur la sclère. Malheureusement, l’irradiation reçue par le patient est souvent mal distribuée pour les cas de tumeurs non sphériques. Ces dernières correspondent à environ 23% des mélanomes uvéaux (e.g. en champignon, plates). La fabrication de formes d’implants personnalisés permettrait un meilleur confort durant le traitement et une diminution des complications oculaires post-irradiation. L’objectif du projet est de recréer in vitro une demi-sphère reproduisant l’anatomie de l’œil avec une tumeur choroïdienne afin de tester l’efficacité des implants de curiethérapie actuel.

MATÉRIEL ET MÉTHODES: La composition de la matrice extracellulaire choroïdienne ou tumorale a été déterminée grâce à des analyses de profilage génique et à une revue de la littérature. Notre modèle imprimé comprendra les éléments principaux de la matrice extracellulaire de la choroïde et de la sclère, ainsi que des cellules choroïdiennes (fibroblastes, mélanocytes) et des cellules cancéreuses fluorescentes (92.1, Mµ2 et Mel270) plus ou moins radiosensibles. La bio-encre qui sera utilisée avec la bio-imprimante BioX sera composée d’un mélange de collagène et d’alginate. Le modèle imprimé sera conservé dans du milieu de culture pendant 4 jours pour ensuite être irradié avec un implant de curiethérapie pendant 3 jours. La viabilité cellulaire sera ensuite quantifiée en fluorescence.

CONCLUSION: Nos analyses de profilage génique ont permis de comparer la composition de la matrice extracellulaire de la choroïde et de la tumeur uvéale afin de choisir le type de collagène qui sera contenu dans la bio-encre. Des tests de fluorescence sont en cours afin de déterminer la densité optimale des cellules cancéreuses et leur taux de prolifération lorsqu’elles sont enrobées dans un hydrogel pendant 7 jours.

Bio-impression d’un modèle in vivo représentant un œil humain


Sophie Lemay1,2,3, Philippe Gros-Louis1,4,5,6, Julie Bérubé1,5,6, Solange Landreville1,4,5,6, Marc-André Fortin1,2,3
1Centre de Recherche du Centre Hospitalier Universitaire de Québec-UL, Axe Médecine régénératrice, Québec, Qc, Canada 2Département de génie des mines, de la métallurgie et des matériaux, Université Laval, Québec, Qc, Canada 3Centre de recherche sur les matériaux avancés (CERMA), Université Laval, Québec, Qc, Canada 4Département d'ophtalmologie et d’ORL-CCF, Faculté de médecine, Université Laval, Québec, Canada 5Centre de recherche en organogénèse expérimentale de l’Université Laval/LOEX, Québec, Canada 6Centre de recherche sur le cancer de l’Université Laval, Québec, Canada

CONTEXTE ET OBJECTIFS : Le mélanome uvéal représente la majorité des cancers de l’œil. Lorsque ce dernier est situé dans la choroïde, la tumeur est traitée avec une plaque de curiethérapie déposée sur la sclère. La curiethérapie est l’utilisation de sources radioactives pour traiter certains types de cancers (e.g. œil, prostate, sein). Présentement, l’efficacité des plaques de curiethérapie est validée à l’aide de moyens physiques. Cependant, ces techniques ne prennent pas en considération les différents niveaux de radiosensibilité des cellules dans une tumeur. De plus, les modèles in vivo se rapprochant de l’œil humain coûtent cher et nécessitent des installations particulières. Ainsi, il est pertinent de concevoir un modèle in vitro à l’aide de la bio-impression d’hydrogel afin de valider l’efficacité des implants de curiethérapie. L’objectif de ce projet consiste à concevoir un modèle imprimable comprenant une choroïde, une sclère et un mélanome qui reproduit l’anatomie de l’œil afin de tester l’efficacité et la fonctionnalité des implants de curiethérapie actuelle. 

MATÉRIEL ET MÉTHODES: L’impression du modèle in vitro est effectuée avec une bio-imprimante (BioX, Cellink, Suède). Cette technologie permet d’imprimer des hydrogels par extrusion et d’obtenir une géométrie spécifique, dans le cas présent une demi-sphère, qui se rapproche de la forme de l’œil humain. Un mélange d’hydrogel composé de collagène de type I et d’alginate est utilisé comme bio-encre. Le collagène de type I se retrouve naturellement dans la sclère et dans la choroïde et l’alginate permet à l’hydrogel d’être suffisamment visqueux pour l’impression. Les lignées cancéreuses 92.1, Mµ2 et Mel270 sont cultivées pour recréer des tumeurs primaires de mélanome choroïdien à radiosensibilité variable. Des fibroblastes et/ou des mélanocytes choroïdiens sont utilisés pour reproduire la choroïde et la sclère. Le modèle imprimé est conservé dans du milieu de culture pendant 7 jours.

Dans un premier temps, les concentrations de collagène, d’alginate, ainsi que la concentration de cellules sont optimisées afin de produire un hydrogel ayant les propriétés physiques recherchées (viscosité, viabilité de cellules). Par la suite, les paramètres d’impression (vitesse, température, pression) permettant d’obtenir une structure uniforme et reproductible seront déterminés. Finalement, des tests de viabilité cellulaire seront faits pour s’assurer que les cellules survivent 7 jours post-impression.

Cancer de la vessie et bisphénols : les liaisons dangereuses.


Felix-Antoine Pellerin11, Stéphane Chabaud11, Frédéric Pouliot33, Martin Pelletier22, Stéphane Bolduc1.1
11 Centre de recherche en organogénèse expérimentale/LOEX, Axe Médecine Régénératrice, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, Québec, QC, Canada 22 Axe Maladies Infectieuses et Immunitaires, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, Québec, QC, Canada 33 Axe Oncologie, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, Québec, QC, Canada

CONTEXTE ET OBJECTIFS 

Les bisphénols (BP) sont une famille de composés chimiques utilisés pour la fabrication du plastique donc très présent dans notre environnement quotidien.  Le plus connu d’entre eux est le bisphénol A (BPA). Lorsqu’ingérés, dans l’alimentation ou la boisson, ils  peuvent agir comme des perturbateurs endocriniens. Les perturbateurs endocriniens sont des produits naturels ou synthétiques qui peuvent altérer les fonctions endocrines souvent en mimant ou bloquant les hormones endogènes. Le BPA commence à être interdit dans certains produits, particulièrement ceux dédiés aux jeunes enfants. Néanmoins,  les alternatives au BPA font aussi eux aussi partie de la grande famille des BP comme le bisphénol S (BPS) et présentent les mêmes problèmes reliés à la santé, dont le développement de cancers.

Dans le laboratoire nous nous intéressons au cancer de la vessie. Notre hypothèse serait que comme l’urine contient des BP et restent longtemps en contact avec la muqueuse vésicale, les BP pourraient participer à l’initiation et/ou la progression tumorale.

Notre objectif va être d’évaluer l’effet des BPA, BPS et de leurs métabolites sur la prolifération, la migration et l’activité protéolytique des cellules épithéliales normales ou de de cancer de vessie.

MATÉRIEL ET MÉTHODES :

Des cellules urothéliales saines (Hu1 et Hu5), des cellules cancéreuses non-invasives (RT4) et invasive (T24) ont été utilisées. Les différentes cellules ont été conditionnées avec différents concentrations de BPA, BPS et  de leurs métabolites.

L’effet des bisphénols ou de leurs métabolites sur la prolifération des cellules était évalué sur 3 jours en utilisant un  compteur de cellules  Z2 de Beckmann-Coulter.

 Pour ce qui est de la migration, un scratch-test était effectué et la migration des cellules était suivie pendant 48 heures par microscopie Time-lapse puis  analysée par ImageJ pour déterminer la surface recouverte par les cellules.

Enfin, le dosage de MMP actives sécrétées par les cellules à été réalisée en utilisant un kit Sensolyte 520 Generic MMP Assay et le clivage su substrat fluorogénique fut ensuite analysé par fluoromètrie.

RÉSULTATS : Les résultats sont présentement en cours d’analyse.

CONCLUSION : Nos études permettront de déterminer si les BP ont un effet sur l’initiation et la progression tumorale dans un système bidimensionnel. Si c’est le cas, des études plus approfondies, dans un contexte tridimensionnel produit par génie tissulaire seront entamées.

Caractérisation des vésicules extracellulaires sécrétées par les cellules du mélanome uvéal et de leur internalisation dans les cellules stellaires hépatiques


Nathan Schoonjans1, Léo PIQUET1,2,3,4, Julie Bérubé1,3,4, Alain Brisson5, Solange Landreville1,2,3,4
1CUO-Recherche et Axe médecine régénératrice, Centre de recherche du CHU de Québec-Université Laval, Québec, Canada 2Département d’ophtalmologie et d’ORLCCF, Faculté de médecine, Université Laval, Québec, Canada 3Centre de recherche sur le cancer de l’Université Laval, Québec, Canada 4Centre de recherche en organogénèse expérimentale de l’Université Laval/LOEX, Québec, Canada 5UMRCBMN CNRS, Université de Bordeaux, Bordeaux, France

CONTEXTE ET OBJECTIF : Le mélanome uvéal est la tumeur oculaire la plus fréquente chez l'adulte et est récalcitrant aux traitements lorsque disséminé au foie. Notre hypothèse est que les vésicules extracellulaires (VEs) qui sont sécrétées par la tumeur oculaire voyagent dans le sang pour modifier le microenvironnement hépatique par le biais des cellules stellaires hépatiques (CSHs). Ce projet de recherche vise à caractériser les VEs d’un point de vue structural et fonctionnel, afin de déterminer leur implication dans les interactions synergiques entre les CSHs et les cellules métastatiques du mélanome uvéal.

 

MATÉRIEL ET MÉTHODES : Les VEs de lignées cancéreuses dérivées de tumeurs oculaires ou de métastases hépatiques ont été isolées par centrifugation différentielle et leurs nombre/taille ont été déterminés par des analyses en cytométrie de flux à haute sensibilité et par microscopie électronique. La présence de marqueurs classiques des VEs (tétraspanines CD9/CD81) et de marqueurs de mélanome (MART1/TYRP1/HTR2B) a été évaluée par immunobuvardage Western. Des études fonctionnelles ont ensuite été réalisées avec des cellules hépatiques. L’internalisation des VEs fluorescentes du mélanome uvéal par les CSHs a été quantifiée par microscopie confocale et cytométrie de flux. Leur activation subséquente a été étudiée par microscopie confocale avec les marqueurs alpha-SMA et phalloïdine. L’impact des VEs (issues des lignées UM001 et HSteCs) sur l’invasion a été observé à l’aide d’un modèle de sphéroïdes tumoraux (MU2 et MU2F) enrobés dans le Matrigel.

 

RÉSULTATS : Les VEs de mélanome uvéal exprimaient les tétraspanines, ainsi que certains marqueurs du mélanome. Les CSHs ayant internalisé les VEs du mélanome uvéal exprimaient davantage d’alpha-SMA. Les analyses en cytométrie de flux à haute sensibilité ont permis de quantifier la concentration des VEs et de déterminer leur distribution selon la taille. L’ajout de VEs UM001 et HSteCs sur des sphéroïdes tumoraux a déclenché un processus d’invasion.

 

CONCLUSION : Les cellules métastatiques du mélanome uvéal produisent des VEs capables d’activer les CSHs. L'analyse des VEs plasmatiques chez les patients atteints de mélanome uvéal à différents stades de la maladie pourrait aider à définir de nouvelles stratégies pour surveiller la progression de ce cancer et sa réponse aux traitements.

 

Complications évolutives associées au traitement chirurgical des prolapsus génitaux


Yuling Wu1, Gaëtan Brochu1, Geneviève Nadeau1, Ze Zhang1, Robert Guidoin1
1Departement de Chirurgie, Université Laval et Axe de Médecine Régénérative, Centre de Recherche, CHU de Québec, Québec (QC)

MISE EN CONTEXTE

Le prolapsus génital correspond à la descente d’un organe à travers le vagin. La forme la plus fréquente est la descente de la vessie ou la cystocèle. Le bombement du rectum contre la paroi du vagin correspond à la rectocèle et la descente de l’utérus dans la vagin ou prolapsus utérin. La colpocèle se produit par descente du fond du vagin après hystérectomie et l’entérocèle lors du bombement du petit intestin à travers le vagin. Le traitement du prolapsus vaginal requiert le traitement chirurgical s’il faut remplacer les moyens de suspension ou les moyens de soutènement devenus défaillants.

CAS CLINIQUES

Nous avons recueilli 9 explants provenant de 7 patientes agées de 39 à 73 ans. Les prothèses furent initialement implantées pour colpocèle, rectocèle et cystocèle. Il s’agissait de prothèse synthétiques tissée ou tricotée faites de polypropylène monofilament. Les exérèses suivaient les récurrences de la colpocèle, l’érosion vaginale ou la réaction à corps étranger. Les analyses des explants en microscopie électronique à balayage, en microscopie optique et en microscopie électronique à transmission ont permis une série d’observations préliminaires. A l’exception de la prothèse ayant causé une réaction à corps étranger, tous les explants étaient dénués de toute encapsulation. Les prothèses associées à des érosions vaginales incorporaient d’abondants colonialismes bactériens. Les faisceaux de collagène de ces prothèses étaient en voie de dégradation. En autre, la surface des monofilaments de polypropylène montrait des degrés d’oxydation variables.

CONCLUSION:

Le taux élevé de complications évolutives associées au traitement chirurgical des prolapsus génitaux suscite une controverse. Pour la FDA, le risque de corriger chirurgicalement les prolapsus génitaux mérite une étude en profondeur. Il convient donc de valider les techniques chirurgicales, les indications et les prothèses.

Conservation du membre inférieur gauche plutôt que l’amputation


Tianyi Zhou1, Guillaume Febrer1, Yvan Douville1, Ze Zhang1, Robert Guidoin1
1Département de Chirurgie, Université Laval et Axe de Médecine Régénérative, Centre de Recherche, CHU de Québec, Québec (QC).

MISE EN CONTEXTE: L’ischémie critique d’un membre inférieur requiert une revascularisation pour éviter la perte du membre. Que ce soit par approche endovasculaire ou par chirurgie, la procédure représente un défi considérable car les patients sont âgés, les artères de petite taille, calcifiées ou obstruées sur de longue distance et avec une résistance d’aval importante. L’amputation ne saurait être considérée tant que le membre peut être revascularisé.

CAS CLINIQUE: Patient de 64 ans hospitalisé depuis deux mois avec une ischémie critique et des ulcères mixtes au membre inférieur gauche. Après des échecs répétés de revascularisation par endartériectomie et déploiement d’un stent, un conduit composite impliquant deux segments d’artère fémorale superficielle après endartériectomie et une veine saphène cryopréservée fut mise en place. Des épisodes infectieux avec thrombose et formation anévrysmale sur la veine cryopréservée suivirent. Le succès final fut obtenu après exérèse de l’anévrysme et mise en place d’un pontage autologue des veines céphalique et basilique. Quatre années plus tard, le pontage est toujours perméable.

ANALYSE DE LEXPLANT: L’anévrysme fut comparé à des contrôles et examiné en histologie par microscopie électronique à balayage, microscopie optique et microscopie électronique à transmission. L’allogreffe veineuse ne s’était pas artérialisée et les faisceaux de collagène étaient sérieusement dégradés bien que les filaments soient demeurés individualisés avec des striations régulières. La présence de Pseudomonas aeruginosa dans la paroi de l’homogreffe veineuse fut mise en évidence et a vraisemblablement contribué à la dégradation du conduit.

CONCLUSION: Ce cas clinique illustre la dégradation rapide d’une allogreffe en cas d’infection pour expliquer l’apparition de l’anévrysme et la supériorité de l’autogreffe veineuse dans les pontages distaux grâce à sa tolérance à un débit sanguin faible et sa résistance à l’infection.

Corrélation in vitro du profil psoriasique de peaux reconstruites en fonction du score PASI des patients


Maxime Kusik1, Rémy Pépin1, Sabrina Bellenfant1, Roxane Pouliot1, François Berthod1
1Université Laval

INTRODUCTION : Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique affectant 2% de la population canadienne. Cette maladie est associée à plusieurs comorbidités, tel que des problèmes cardiaques, l’arthrite et la dépression.

Le psoriasis se caractérise par l’apparition de lésions se démarquant par un épaississement de l’épiderme ainsi qu’une augmentation de la vascularisation et de l’innervation de la peau. Ces lésions se distinguent par une prolifération excessive et une différenciation anormale des kératinocytes conjointement à une activité inflammatoire chronique. La sévérité de la maladie peut être quantifiée par le «Psoriasis Area and Severity Index» (PASI) qui prend en compte la rougeur, l’épaisseur et la desquamation ainsi que la superficie des lésions.

OBJECTIF : Afin de modéliser in vitro l’influence de l’innervation cutanée sur la formation des lésions psoriasiques, dix patients ayant des scores PASI variés ont été recrutés, allant de 3 (atteinte légère) à 36 (atteinte sévère). Nous souhaitons maintenant analyser si ces différences dans le niveau de sévérité de la maladie peuvent être reproduites par notre approche de modélisation du psoriasis.

Pour ce faire, des peaux reconstruites psoriasiques innervées seront produites par génie tissulaire en utilisant chacune des lignées de fibroblastes et kératinocytes non-lésionnels ou lésionnels provenant des patients psoriasiques en comparaison à des lignées de cellules saines. Les profils psoriasiques obtenus seront comparés en les corrélant avec leur index PASI respectif.

MATÉRIEL ET MÉTHODES : Chaque population cellulaire a été cultivée sur des éponges de collagène III bovin/chitosan en immersion. Ensuite, chaque éponge a été placée sur un support, créant une interface air-liquide permettant la formation d’un épiderme. À la fin de la culture air-liquide, les échantillons ont été fixés afin d’effectuer des coupes histologiques pour mesurer l’épaisseur des épidermes et des analyses par immunofluorescence.

RÉSULTATS : Les photographies macroscopiques des éponges suggèrent la présence d’un épiderme, démontrant que les résultats sont prometteurs. Cependant, la mesure de l’épaisseur de l’épiderme ainsi que la quantification par immunofluorescence du nombre des kératinocytes en prolifération, présentement en cours, seront nécessaires afin de démontrer une différence entre les épidermes des peaux reconstruites selon leur score PASI respectif.

CONCLUSION : Pour pouvoir valider l’efficacité de notre modèle de peau reconstruite psoriasique innervée à reproduire le profil de la maladie in vitro, il est essentiel de montrer que le profil est amplifié lorsque les cellules utilisées proviennent d’un patient plus sévèrement atteint. En perspective, de futures expériences seront effectuées afin de montrer que la réponse de ces cellules sera proportionnelle à leur score PASI suite à une stimulation nerveuse.

Effet des milieux conditionnés par les cellules stromales sur la prolifération et la migration des cellules urothéliales


Tarek Omaiche1, Christophe Caneparo1, Stéphane Bolduc1
1Centre de recherche du CHU de Québec/LOEX

CONTEXTE ET OBJECTIFSLa bonne cicatrisation d’une plaie urologique dépend de la prolifération et de la migration des cellules urothéliales afin de combler l’espace de la plaie. L’urine est une composante toxique et il est essentiel de la confiner. Pour diminuer les risques de fuites d’urine et d’infections suite à une plaie urologique, il est avantageux de trouver des moyens d’accélérer le processus de guérison. L’hypothèse de mon stage est que les cellules mésenchymateuses de vessie (BMC) sécrètent des facteurs spécifiques utiles à la cicatrisation des plaies urologiques. L’objectif du projet est d’évaluer la vitesse de prolifération et de migration des cellules urothéliales dans différentes conditions expérimentales (milieux conditionnés de BMC, de fibroblastes dermiques (DF), diverses concentrations de sérum de fœtus de veau).

 

MATÉRIEL ET MÉTHODES : Des monocouches de cellules urothéliales seront utilisées dans un premier temps. Les milieux conditionnés seront produits par 3 populations de BMC et 3 populations de DF cultivés dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DME) + 1% d’albumine bovine sérique (BSA) et récoltés à 3 temps différents (1, 4 et 7 jours). Un contrôle négatif DME + 1% BSA sera également utilisé ainsi que deux contrôles positifs DME + 5% ou 10% de sérum de fœtus de veau. Les milieux sont ensuite placés sur des cellules urothéliales ensemencés sur des plaques de 96 puits et la prolifération est mesurée à l’aide d’une solution soluble de tetrazolium (WST-1) aux jours 1, 2 et 3. Pour tester la migration des cellules, les cellules urothéliales sont ensemencées sur des plaques de 12 puits à 100% confluence, un scratch est effectué et les milieux sont ajoutés. Des photos effectuées à 3, 6, 9 heures et le lendemain permettront de mesurer la vitesse de fermeture de la plaie. 

 

RÉSULTATS : Bien que nous n’ayons pas encore les résultats, nous pensons que le milieu conditionné par les BMC est le plus susceptible d’aider les cellules urothéliales à proliférer et migrer rapidement. Celui des DF devrait être moins bien adapté.

 

CONCLUSION : Mon stage est la première étape d’un projet qui, suite à l’identification d’un milieu favorable à la cicatrisation des plaies urologiques, permettra d’en isoler les composantes moléculaires. Dans l’idéal, ces molécules associées à un scellant de type fibrine ouvrirait une avenue thérapeutique pour les patients ayant des problèmes de cicatrisation de plaies urologiques.

Effets de l’inhibition de la capture d’exosomes dérivés de cancer de la vessie sur la progression tumorale.


Emil Grammond1, Stéphane Chabaud1, Stéphane Bolduc1
1centre de recherche du CHU de québec/LOEX

CONTEXTE ET OBJECTIFS Le cancer de la vessie (BCa) est l’un des cancers les plus communs au Canada. Afin de progresser et d’établir des métastases le cancer doit traverser l’épithélium, pénétrer dans le stroma et atteindre la circulation sanguine. Pour se faire, les cellules cancéreuses relâchent des vésicules extracellulaires appelées exosomes. Ceux-ci sont capturés par endocytose par les cellules mésenchymateuses de vessie (BMC) ce qui induit la transition  phénotypique de ces cellules en fibroblastes associés au cancer (CAFs) qui aident à la progression tumorale. 

Notre hypothèse est que le blocage de l’endocytose des exosomes réduirait la progression du BCa. 

L’objectif principal de mon stage  de recherche consiste à démontrer, à l’aide du modèle tridimensionnel (3D) de BCa par auto-assemblage, qu’il est possible de limiter la transition des BMC en CAFs à l’aide d’un inhibiteur d’endocytose, la Chlorpromazine (CPZ), tout en conservant une viabilité élevée pour les tissus sains et ainsi, freiner le progrès du BCa dans le tissu reconstruit. 

MATÉRIEL ET MÉTHODES Des cultures monocouches de BMC ou des gels de collagène ensemencés de BMC avec ou sans épithélium ont servi à déterminer la toxicité du CPZ à différentes concentrations. 

Cent-huit tissus 3D (stroma + épithelium) ont alors été reconstruits par auto-assemblage pour évaluer l’effet du CPZ sur la progression tumorale (triplicata, 3 concentrations de CPZ, 2 types de cellules BCa - RT4 dsRed (non-invasif) et T24 dsRed (invasif)- et leur contrôle, 4 temps de récolte des tissus 2, 5, 8 et 12 jours post implantation). Les sphéroïdes de cellules BCa, produites par la technique de la goutte suspendue, ont été déposées en groupe de trois au centre du tissu après 10 jours de maturation air liquide (présence de lame basale). Les tissus ont ensuite été exposés à 0 uM, 6.25 uM et 12.5 uM de CPZ puis les tissus fixés aux temps indiqués.

RÉSULTATS Bien que l’analyse complète ne soit pas terminée, plusieurs tests ont été réalisés. Tout d’abord, nous avons vérifié que l’on pouvait mesurer le transfert de fluorescence dsRed médiée par les exosomes dans les BMC. Nous avons ensuite montré que des concentrations de CPZ de 6.25 uM et 12.5 uM étaient non toxiques. 

CONCLUSION En conclusion, nous nous attendons à observer une diminution de la progression des sphéroïdes cancéreuses T24 dans le modèle d’auto-assemblage à concentrations 6,25 uM et 12,5 uM sans que ces concentrations ne soient toxiques pour le tissu sain. 

Encapsulation de médicaments par des nanoparticules d’or pour la thérapie oculaire


Gabrielle Raîche-Marcoux1,2, Florence Masse1,2, Elodie Boisselier1,2
1Département d’ophtalmologie, Faculté de médecine, Université Laval; 2CUO-recherche, Centre de recherche du CHU de Québec, Hôpital du Saint-Sacrement

CONTEXTE ET OBJECTIFS : Malgré la grande concentration en agents thérapeutiques des gouttes ophtalmiques, plus de 99,9% de ces molécules sont éliminées par le film lacrymal lors de l’application topique. L’augmentation de la biodisponibilité, et donc de l’efficacité, de l’agent actif doit passer par l’optimisation de la mucoadhésion du vecteur du médicament. En effet, plusieurs agents actifs sont hydrophobes, peu solubles et parfois peu stables. C’est lors de ces situations que le rôle et le choix du vecteur sont importants. Les nanoparticules d’or sont des candidates prometteuses grâce à leur non-toxicité et leur ultrastabilité. Le flurbiprofène est un anti-inflammatoire vendu en gouttes ophtalmiques qui est souvent prescrit à la suite d’une chirurgie de la cataracte et qui doit être appliqué de façon topique trois fois par jour par le patient. L’utilisation des nanoparticules d’or dans ce cas-ci pourrait permettre au patient de réduire la fréquence d’application de ces gouttes ophtalmiques tout en augmentant l’efficacité de celles-ci. Les objectifs de ce projet consistent donc de mesurer la mucoadhésion des nanoparticules puis de quantifier l’encapsulation du flurbiprofène par les nanoparticules.

MATÉRIEL ET MÉTHODES : Les nanoparticules d’or ont été synthétisées en laboratoire puis caractérisées par microscopie électronique à transmission, par analyse élémentaire, par spectroscopie UV-visible et par diffusion dynamique de la lumière. La mucoadhésion a été mesurée par spectroscopie UV-visible à l’aide de la coloration Periodic Acid Schiff. L’encapsulation du flurbiprofène a été mesurée indirectement par chromatographie en phase liquide à haute performance.

RÉSULTATS : Après synthèse et caractérisation des nanoparticules d’or, l’étude de la mucoadhésion indique que 59,8% des mucines ont adhéré aux nanoparticules. De plus, pour un ratio de 1:10 (nanoparticules:flurbiprofène), l’agent actif a été encapsulé à 7% alors qu’avec un ration de 1:20, le flurbiprofène a été encapsulé à 21%.

CONCLUSION : Ces travaux démontrent que les nanoparticules d’or sont des vecteurs de médicaments prometteurs pour la thérapie oculaire grâce à leur importante mucoadhésion et leur grande capacité d’encapsulation.

Étude d'imprimabilité d'implants de curiethérapie pour l'oeil en polyétheréthercétone.


Jonathan Lévesque1, Théophraste Lescot1,2,3, Marc-André Fortin1,2,3
1Centre de Recherche du Centre Hospitalier Universitaire de Québec-UL, Axe Médecine régénératrice, Québec, Qc, Canada 2Département de génie des mines, de la métallurgie et des matériaux, Université Laval, Québec, Qc, Canada 3Centre de recherche sur les matériaux avancés (CERMA), Université Laval, Québec, Qc, Canada

CONTEXTE ET OBJECTIFS : La curiethérapie est un traitement utilisant des sources radioactives qui permet de traiter certains types de cancer (e.g. prostate, sein). Dans le cas particulier d’un cancer de l’œil (mélanome uvéal), l’utilisation d’implants radioactifs s’avère un traitement efficace. Les implants sont composés d’une plaque de métal sphérique permettant à la fois de maintenir en place des sources radioactives et de bloquer les radiations émises afin de protéger les tissus sains. En contrepartie, l’épaisseur et la géométrie de ces implants ne sont souvent pas adaptées à l’œil du patient. En effet, les implants actuels sont trop épais et créent de l’inconfort.

En conséquence, l’introduction de nouvelles méthodes pour la fabrication d’implants personnalisés permettrait d’améliorer le confort et le processus de guérison du patient, ainsi que d’augmenter le taux de succès de ces interventions. L’objectif de ce projet est de concevoir et de fabriquer des plaques plus minces, faites de polymère et accueillant les sources radioactives standards, ainsi que de personnaliser leur taille et leur forme en se basant sur des données d’imagerie médicale. Pour ce faire, la fabrication additive (impression 3D) sera utilisée.

 

MATÉRIEL ET MÉTHODES : Des formes d’implants de curiethérapie de l’œil basés sur la géométrie des implants actuels ont été imprimés par FA (impression 3D). La conception des implants est effectuée avec le logiciel Creo Parametric (PTC, Canada). Les implants sont imprimés avec une imprimante P220 (APIUM, Allemagne). Le matériau d’impression pour ce projet est le polyétheréthercétone (PEEK), connu pour ses propriétés mécaniques, sa biocompatibilité et sa stabilité chimique lors de la stérilisation.

 

RÉSULTATS : Des modèles analogues aux plaques standards actuelles de tailles 12 mm, 16 mm et 20 mm, ont été imprimés en PEEK, confirmant ainsi la possibilité de fabriquer des implants à l’aide la FA. Celle-ci permet tant qu’à elle, la personnalisation éventuelle des implants.

 

CONCLUSION : La fabrication par FA de modèles de plaques oculaires pour la curiethérapie à base de PEEK a été démontrée. L’étape suivante est l’impression d’implants personnalisés basés sur des images anatomiques (IRM) d’un œil de porc ou de mouton. Cela permettra de confirmer la possibilité de produire des implants oculaires de curiethérapie par FA, qui soient conformes à la géométrie de l’œil d’un individu.

Incidence du traitement et des propriétés des cornées cadavériques sur la qualité des cellules endothéliales cornéennes en culture


Antoine Blaquière1,3, Mathieu Thériault2, Kim Santerre1,3, Stéphanie Proulx1,3
1Département d’ophtalmologie et d’ORL–CCF, Faculté de médecine, Université Laval 2Centre de recherche du CHU de Québec-Université Laval, axe médecine régénératrice 3Centre de recherche en organogénèse expérimentale de l’Université Laval/LOEX

CONTEXTE ET OBJECTIFS : Les endothéliopathies sont des maladies qui ne peuvent être traitées que par la greffe de cornée. Un donneur d’organe ne pouvant traiter que 2 yeux, l’amplification des cellules in vitro devient une alternative intéressante qui permettrait de traiter 27 yeux à partir d’un seul donneur. Cependant les cellules endothéliales cornéennes (CECs) en culture ne sont pas égales dans leur capacité à reformer un endothélium fonctionnel. Le but de ce projet est de déterminer si certains paramètres des cornées cadavériques influencent la qualité des CECs en culture.

MATÉRIEL ET MÉTHODES : Les photos en contraste de phase (n=131) ont été utilisées pour mesurer la morphologie (indice de circularité; IC) à l’aide du logiciel ImageJ. Le critère d’inclusion pour les CECs de qualité était un IC 0.69 (CECs avec morphologie endothéliale), et 0.63 pour les CECs non-fonctionnelles (CECs avec morphologie fibroblastique). Différents paramètres ont été étudiés: les cornées fraîches versus celles préservées dans l’Optisol, l’âge du donneur, la méthode de mise en culture (collagénase ou éthylènediaminetétraacétique; EDTA) ainsi que différents délais entre le décès, le prélèvement de la cornée, le temps de préservation dans l’Optisol, le pelage de la membrane de Descemet (DM), et la mise en culture des CECs.

RÉSULTATS : Une corrélation entre l’âge et l’IC a été observée avec une diminution de (2±5)x10-3 (Optisol) et (3±1)x10-2 (fraîches) de l’IC par décennie. Des 131 populations analysées, 39 étaient des CECs à caractère endothélial dont 72% avaient été préservées dans l’Optisol pour en moyenne 11±5 jours. L’isolation à la collagénase et à l’EDTA a respectivement généré 49% et 41% de CECs endothéliales. Les délais « décès-prélèvement de la cornée » et « pelage de la DM-mise en culture » étaient respectivement de 0.7±0.2 et 2±1 jours (Optisol), et 4±3 et 3±1 jours (fraîches). En comparaison, 46 populations étaient des CECs à caractère fibroblastique, dont 72% provenaient de cornées préservées dans l’Optisol pour en moyenne 9±6 jours. L’isolation à la collagénase et à l’EDTA a respectivement généré 30% et 61% de cultures de CECs « fibroblastiques ». Les délais « décès-prélèvement de la cornée », et « pelage de la DM-mise en culture » étaient respectivement 0.7±0.2 et 3±3 jours (Optisol), et 4±2 et 2±1 jours (fraîches).

CONCLUSION : L’analyse montre que les délais et la méthode de mise en culture n’ont pas d’influence majeure sur la morphologie des CECs cultivées. Puisque la morphologie se dégrade en fonction de l’âge pour les cornées fraîches, il sera important de d’isoler des CECs provenant de cornées non-préservées et de donneurs de 65 ans et moins dans le futur afin d’augmenter la production de CECs ayant un phénotype fonctionnel.

Interactions membranaires des protéines S100A1 et S100B.


Paul Jaouen1,2, Florence Guérin1,2, Trystan Lessard1,2, Élodie Boisselier1,2
1Département d’ophtalmologie, Faculté de médecine, Université Laval 2CUO-recherche, Centre de recherche du CHU de Québec, Hôpital du St-Sacrement.

CONTEXTE ET OBJECTIFS : Dans les cellules nerveuses de la rétine se trouvent la guanylate cyclase 1 (GC1). Elle participe à la conversion du signal lumineux en signal électrique de la vue en catalysant la transformation de la guanosine triphosphate (GTP) en guanosine monophosphate cyclique (GMPc). Différentes protéines activatrices participent à la régulation de son activité de phototransduction : la GCAP (protéine activatrice de la guanylate cyclase) dans les photorécepteurs, la neurocalcine delta dans les cellules amacrines et ganglionnaires ainsi que les protéines S100B et S100A1 dans les cellules gliales de Müller. La participation des protéines S100A1 et S100B à la régulation de la phototransduction par le guanylate cyclase se fait grâce à une interaction à la membrane de manière calcium dépendant. Cependant, ces protéines ont peu été étudié et aucune information concernant leurs interactions moléculaires à la membrane n’est connu. Une partie de la protéine S100B serait localisée dans les fractions membranaires résistantes au détergent et sa dimérisation serait favorisée en présence de lipides. Les lipides semblent donc jouer un rôle critique dans l’interaction de ces protéines avec les membranes. Les objectifs de ce projet de recherche consistent à caractériser les interactions membranaires des protéines S100A1 et S100B afin de mieux comprendre leurs rôles dans la régulation de l’activité de GC1.

 

MATÉRIEL ET MÉTHODES : À partir de vecteur d’expression bactériens, les protéines S100A1 et S100B ont été surexprimées dans une souche bactérienne Escherichia Coli, puis purifiées avec différents types de précipitation et chromatographies. Des informations sur l’interaction de ces protéines avec la membrane ont ensuite été obtenues à l’aide du modèle des monocouches de Langmuir qui permet de mimer un feuillet de membrane cellulaire. Deux paramètres de liaison, la pression d’insertion maximale et la synergie, peuvent être calculés et permettent de comparer l’affinité de ces deux protéines pour différents lipides retrouvés physiologiquement dans les membranes.  

 

RÉSULTATS : La protéine S100B a été surexprimée et purifiée. Les expériences de liaison membranaire démontrent que la protéine possède une affinité particulière pour les lipides ayant une tête polaire de type phosphatidyléthanolamine et des chaînes acyles saturées. Les travaux de surexpression de la protéine S100A1 sont actuellement en cours.

 

PERSPECTIVES : Il est nécessaire de compléter l’étude de S100B avec différents lipides ainsi qu’étudier l’influence du calcium afin de mieux caractériser son interaction membranaire. Des travaux semblables seront réalisés avec la protéine S100A1 ainsi que l’hétérodimère S100A1/S100B. Finalement, des études d’interactions lipidiques avec d’autre modèle membranaire, tels que des bicouches, seront réalisées afin de valider leurs comportements membranaires.

Le rôle des microtubules dans la distribution de la transglutaminase 1 lors de la différenciation des kératinocytes.


Emilie Doucet1, Carolyne Simard-Bisson1, Danielle Larouche1, Lucie Germain1
1Faculté de médecine, Université Laval; Centre de recherche en organogénèse expérimentale de l'Université Laval / LOEX; CRCHU de Québec – UL.

CONTEXTE ET OBJECTIFS : L’assemblage de l’enveloppe cornée de la peau est nécessaire pour la différenciation épidermique et la fonction de barrière cutanée. La transglutaminase 1 (TG1) a un rôle important dans ce processus. Plusieurs facteurs sont connus pour réguler son activité, mais les mécanismes impliqués dans sa localisation à la périphérie cellulaire sont inconnus. L’objectif général de cette étude était d’explorer la possibilité que la distribution de la TG1 à la périphérie cellulaire soit assurée par les microtubules (MT). Trois objectifs spécifiques ont été réalisés :1-étudier la colocalisation de la TG1 et des MT dans des peaux reconstruites (PR) par génie tissulaire, 2-vérifier la présence d’interactions entre la TG1 et les MT dans des fractions de protéines enrichies en MT et finalement, 3-étudier la présence de la TG1 dans des modèles de PR ayant une distribution altérée des MT.

MATÉRIEL ET MÉTHODES : Un modèle de PR humain a été réalisé en ajoutant des kératinocytes sur des feuillets de fibroblastes auparavant cultivés pendant 28 jours avec de l’acide ascorbique. Après une prolifération des kératinocytes pendant 7 jours, les PR ont été cultivées 14 jours à l’interface air/liquide pour permettre la différenciation. Un marquage par immunofluorescence (IF) a été fait pour étudier la colocalisation de la TG1 et des MT dans les PR. Pour étudier l’affinité de la TG1 pour les MT, des tests de co-sédimentation des MT ont été faits sur des cultures de kératinocytes épidermiques humains normaux (KEHN) et la présence de la TG1 a été testée par Western blot dans les fractions de protéines enrichies en MT. Un modèle de PR a été traité au nocodazole à une concentration de 1µM entre les jours 12 et 14 de culture air/liquide afin d’inhiber la distribution des MT en périphérie cellulaire. La présence de la TG1 a été étudiée par IF.

RÉSULTATS : Des marquages en IF ont révélé une colocalisation du signal de la TG1 avec celui des MT. Les tests de co-sédimentation ont montré que la TG1 est liée aux MT dans les KEHN. Suite au traitement des PR avec le nocodazole, une réduction de la TG1 en périphérie cellulaire a été observée.

CONCLUSION : Collectivement, ces résultats montrent que la TG1 interagit avec les MT et que ceux-ci contribuent à la localisation de la TG1 à la périphérie cellulaire. Une optimisation du modèle expérimental permettra d’appuyer les résultats obtenus montrant l’interaction entre la TG1 et les MT lors de la différenciation des kératinocytes.

Les bisphénols pourraient-ils jouer un rôle dans l’initiation et la progression du cancer de la vessie?


Ève Pellerin1, Stéphane Chabaud1, Anthony Kerever2, Frédéric Pouliot3, Martin Pelletier2, Stéphane Bolduc1
11 Centre de recherche en organogénèse expérimentale/LOEX, Axe Médecine Régénératrice, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, Québec, QC, Canada 22 Axe Maladies Infectieuses et Immunitaires, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, Québec, QC, Canada 3Axe Oncologie, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, Québec, QC, Canada

CONTEXTE ET OBJECTIFS : Les plastiques, dont la production est en forte hausse, contiennent souvent des bisphénols (BP) qui agissent comme perturbateurs endocriniens causant des problèmes de santé. Le BP-A est retrouvé dans 90% des échantillons d’urine à des concentrations potentiellement effectrices. Les alternatives au BP-A, comme le BP-S, perturbent aussi le système hormonal. L’exposition aux BP est associée à la progression tumorale via des récepteurs hormonaux dont l’activation joue un rôle dans le développement du cancer de la vessie. Le changement d’un métabolisme mitochondrial vers glycolytique (effet Warburg) est un signe de progression tumorale. Puisque la vessie est exposée chroniquement aux BP via l’urine, notre hypothèse est qu’une exposition à long terme aux BP et leurs métabolites pourraient induire un changement métabolique vers un métabolisme glycolytique, afin de favoriser la progression tumorale.

MATÉRIEL ET MÉTHODES : Des cellules urothéliales saines (UC), cancéreuses non-invasives (RT4) et invasives (T24) de vessie ont été utilisées. L’effet de l’exposition aux BP ou leurs métabolites sur le métabolisme énergétique des cellules a été suivi en temps réel après 24, 48 et 72h d’exposition à l’aide du XF Extracellular Flux Analyser, qui mesure le taux d’acidification extracellulaire (glycolyse) et le taux de consommation d’oxygène (respiration mitochondriale).

RÉSULTATS : Après 24h d’exposition aux BP, le métabolisme énergétique est sévèrement diminué pour les T24. La respiration mitochondriale reste affectée après 72h, tandis que la glycolyse augmente progressivement, imitant possiblement l’effet Warburg. Le métabolisme mitochondrial des RT4 augmente progressivement en fonction du temps d’exposition, tandis que la glycolyse, qui est diminuée après 24 et 48h, est augmentée après 72h d’exposition aux BP. Pour les cellules urothéliales normales, on observe une diminution de la glycolyse à 24h, suivie d’une augmentation après 72h.

CONCLUSION : Le changement métabolique observé chez les cellules cancéreuses non-invasives et invasives de vessie induit à la suite d’une exposition aux bisphénols pourrait mener vers une augmentation de l’agressivité des cellules via un métabolisme plus glycolytique favorisant un apport en énergie. L’augmentation du métabolisme glycolytique des cellules urothéliales normales pourrait signifier une activité physiologique plus importante favorisant un phénotype cancéreux.

Modification and Characterization of Fluoropolymers treated by Low Pressure Plasma


Alexandre Holmes1,2, Morgane Laurent2, Gaétan Laroche1
1Université Laval 2Centre de recherche du CHUQ

CONTEXT AND AIM: Fluoropolymers present good mechanical and chemical resistance, low friction properties and hydrophobic behaviors. They are used in many fields of application, including life sciences. However, their utilization as biomedical surface protection, for example, is limited due to their low surface energy. Surface modification using atmospheric pressure plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) could solve this issue. Previous studies showed that chemical and electrical plasma parameters have an influence on the coating chemistry. The aim of this study was to optimize the treatment of fluoroethylene propylene (FEP) film to enhance adhesion with a substrate. First, deposition conditions were optimized to prevent heterogeneity during continuous treatment. Then, a design of experiments (DOE) was used to determine the most promising deposition conditions.

MATERIAL AND METHODS: Treatments were done using a laboratory scale atmospheric pressure plasma treater sitting atop of a roll-to-roll system. Argon and nitrogen were used as carrier gases to vaporize an organic precursor. The influence of the frequency, duty-cycle and precursor percentage was studied. Surface characterization of the coated films was carried out using contact angle, X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), and infrared spectroscopy (ATR-FTIR) analyses.

RESULTS: XPS analyses demonstrated that the heterogeneity observed during continuous treatment could be successfully reduced by stabilizing the gas mixture for 15 minutes and the plasma discharge for 5 minutes before starting the treatment. On the other hand, ATR-FTIR and contact angle analyses put in evidence that the coatings were thicker when using strong electrical conditions and low precursor percentage in the gas mixture during the PECVD process.

CONCLUSION: FEP films were successfully homogeneously coated during a continuous scrolling. Moreover, the DOE demonstrated that thickness and chemical composition of the coating could be adjusted by varying the gas mixture and the electrical parameters used for the discharge. Further works will involve studying the stability of the coatings synthesized under sterilization conditions.

Optimisation du protocole de purification de la lécithine rétinol acyltransférase tronquée


Jordan Grondin1,2,3, Line Cantin1,2,3, Sarah Roy1,2,3, Christian Salesse1,2,3
1Département d’ophtalmologie, Faculté de médecine, Université Laval 2CUO-Recherche, Centre de recherche du CHU de Québec, Hôpital du St-Sacrement 3Regroupement stratégique PROTEO, Université Laval

CONTEXTE ET OBJECTIFS: Le cycle visuel permet de régénérer le pigment visuel. La protéine lécithine rétinol acyltransférase (LRAT) est impliquée dans ce cycle. Des mutations dans la séquence primaire de la LRAT mènent à des maladies visuelles dont la rétinite pigmentaire et l’amaurose congénitale de Leber. Il est donc important de déterminer sa structure tertiaire (3D) pour élucider son mécanisme d’activité enzymatique ainsi que l’effet de ces mutations sur son activité. Un protocole de purification de la LRAT tronquée (tLRAT), une forme active de la LRAT, avait été échafaudé à l’aide du détergent SDS qui a permis de la solubiliser. Cependant, la valeur de RMSD (root mean square deviation) entre les structures de la tLRAT obtenues par résonance magnétique nucléaire (RMN) était trop élevée pour que le repliement identifié puisse être considéré comme étant valable, vraisemblablement en raison d’une trop grande concentration de SDS. L’objectif du projet de stage consiste donc à trouver un autre détergent qui permettrait d’obtenir la tLRAT sous une forme soluble, stable à long terme, active, pure et en assez grande concentration pour que sa structure puisse être déterminée par des mesures en RMN.

MATÉRIEL ET MÉTHODES: La tLRAT a été surproduite dans E. coli, puis solubilisée à l’aide du SDS et ensuite purifiée par chromatographie d’affinité en testant plusieurs détergents, ainsi que le SDS qui sert de contrôle positif. Les détergents testés incluent le CHAPS, le LDAO, le MAPCHO, le DDMB, l’EMPIGEN, le MNG, et le βOG. Ensuite, la tLRAT a été concentrée puis dessalée pour assurer sa stabilité dans le temps.

RÉSULTATS: Le MAPCHO a permis d’obtenir une pureté estimée à plus de 95% ainsi qu’un rendement total de purification semblable à celui du SDS. De plus, l’activité de la tLRAT correspond à 36% de celle mesurée en présence de SDS. Des résultats prometteurs ont aussi été obtenus avec le LDAO. Cependant, une trop petite quantité de protéine et trop d’impuretés ont été obtenues avec les autres détergents, ce qui empêche les études de la structure de la tLRAT.

CONCLUSION: Le LDAO et le MAPCHO semblent être de bonnes alternatives au SDS. Des mesures en RMN doivent alors être effectuées pour déterminer si ces détergents permettent un bon repliement de la tLRAT. D’autres détergents pourraient aussi être testés, tels le DDM, le C12E8 et le LMPG. Des travaux futurs doivent être entrepris afin d’optimiser la pureté de la tLRAT afin de déterminer sa structure 3D.

Protection des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien contre la mort induite par un stress oxydatif


Julien Blouin1,3, Julie Bérubé2, Kim Santerre1,3, Solange Landreville1,3, Stéphanie Proulx1,3
1Centre de recherche en organogénèse expérimentale de l’Université Laval/LOEX 2Centre de recherche du CHU de Québec-Université Laval, axe médecine régénératrice 3Département d’ophtalmologie et d’ORL – chirurgie cervico-faciale, Faculté de médecine, Université Laval

CONTEXTE ET OBJECTIFS : Le stress oxydatif est un facteur important dans le développement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). La région particulièrement affectée par dans la maladie est l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Notre laboratoire a développé, par génie tissulaire, un modèle 3D de l’EPR et de son stroma sous-jacent, la choroïde. Notre hypothèse est que les mélanocytes du stroma choroïdien protègent l’EPR du stress oxydatif via une signalisation paracrine, médiée par Akt. Les objectifs de ce stage sont d’étudier le rôle des mélanocytes dans la protection de la mort de l’EPR par un stress oxydatif, ainsi que de tester différents agents afin de déterminer s’ils activent la voie Akt dans l’EPR.

 

MATÉRIEL ET MÉTHODES : Différentes combinaisons de tissus 3D ont été reconstruits (choroïdes avec et sans EPR, avec et sans mélanocytes), puis été mis en présence ou non d’un stress oxydatif (solution de tert-butyl-hydroxyperoxide, 250μM, 2h). Les niveaux d’espèces réactives d’oxygène (CellRox) et la mort cellulaire (Ethidium homodimer) ont ensuite été étudiés. Une analyse des données de profilage génique a aussi été effectuée afin d’identifier les protéines sécrétées majoritairement par les mélanocytes. Parallèlement, des cultures d’EPR ont été mises en présence ou non de différents agents (MT002, MT131, MT132 et AT010, 1000nM, 16h). Les protéines ont été récoltées et l’expression d’Akt phosphorylé a été déterminée  par immunobuvardage de type Western.

 

RÉSULTATS : La présence de mélanocytes a fait diminuer l'intensité du CellRox de 45% en condition de stress oxydatif en plus de réduire de 92% la mort des cellules de l'EPR. L’analyse du profilage génique a permis d’identifier le gène du facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) comme protéine potentiellement responsable de la protection de l’EPR par les mélanocytes choroïdiens. Du côté des agents testés, la présence de MT132 entraînait un niveau relatif de phosphorylation d’Akt 5 fois plus élevé que pour le contrôle sans activateur.

 

CONCLUSION : Les mélanocytes protègent l’EPR de la mort induite par un stress oxydatif. Les milieux conditionnés seront étudiés afin d’identifier les facteurs sécrétés responsables de cette protection. Le PEDF ressort comme un candidat intéressant pour la suite des travaux. Certains agents, comme MT132, ont activé Akt, et leur rôle dans la protection contre le stress oxydatif reste à déterminer. Notre modèle permet d'envisager trouver une thérapie pour les patients atteints de DMLA.

Prothèses intraosseuses percutannées : Etapes de développement et mise sur le marché d’un nouveau produit


Mathilde MASSONIE1, Andrée-Anne GUAY-BEGIN1, Souhaila GHADHAB1, Gaétan Laroche1
1Université Laval

OBJECTIF ET CONTEXTE: L’amputation des membres inférieurs a une incidence de 2.8 à 43.9 pour 100 000 individus. Suite à une amputation au-dessus du genou, seulement 20% des patients seront capables de se déplacer de manière autonome.

Pour tenter de répondre à ce problème, de nouvelles prothèses osseuses percutanées ont été développées. Parmi elles, les ITAPS (intraosseous transcutaneous amputation prostheses) sont des prothèses en titane munies d’une collerette sous-cutanée permettant la croissance des tissus mous sous-jacents. Cependant, l’un des défis majeurs est d’assurer la jonction entre l’implant et le tissu cutané environnant pour combler la brèche existante, propice à l’infiltration de bactéries occasionnant des infections pouvant conduire, dans des cas extrêmes, au retrait de l’implant.

 

Le stage réalisé s’inscrit dans le cadre d’un projet industriel avec la firme Bodycad, spécialisée en orthopédie. Il se compose de deux volets à savoir une partie de recherche fondamentale visant à modifier la surface des prothèses par greffage de molécules antibactériennes et permettant une meilleure insertion tissulaire, et une partie s’intéressant aux différentes étapes de mise sur le marché américain de la prothèse à être développée.

 

MATERIELS ET METHODES: La fibronectine, glycoprotéine de la matrice extracellulaire ainsi que la vancomycine, antibiotique communément utilisé en milieu hospitalier, sont greffés sur le titane par le biais de phosphonates hétérobifonctionnels. Le greffage de différentes concentrations de ces composantes a pu être testé et analysé, notamment par mesure de l’intensité de fluorescence de sondes greffées à des anticorps spécifiques aux molécules d’intérêt par microscopie confocale.

Pour le volet portant sur la mise en marché, une recherche bibliographique portant sur l’étude des produits concurrents (prothèses et revêtements) ainsi que sur les différentes voies permettant l’acceptation du produit par la Food and Drug Administration a été réalisée.

 

CONCLUSION: Les prothèses intraosseuses transcutanées sont porteuses d’un avenir prometteur pour les patients amputés. De nombreux dispositifs et traitements sont en cours de développement. Cependant, leur entrée sur le marché reste encore timide bien que les premières études cliniques montrent des résultats encourageants.

Surexpression et purification des formes non-acylée et acylée de la rhodopsine kinase


Benoît Labrecque1,2, Marc-Antoine Millette1,2, Line Cantin1,2, Christian Salesse1,2
1Département d'ophtalmologie, Faculté de Médecine, Université Laval 2CUO-recherche, Centre de recherche du CHU de Québec, Hôpital Saint-Sacrement

CONTEXTE ET OBJECTIFS : La rhodopsine est le pigment visuel photosensible dans le segment externe des bâtonnets. L’absorption d’un photon par la rhodopsine débute la cascade de phototransduction visuelle qui consiste en une série de réactions biochimiques impliquant plusieurs protéines. Ce processus permet de convertir le signal lumineux en un signal électrique qui est transmis au cerveau. L’inactivation des protéines de la phototransduction visuelle est critique pour maintenir la sensibilité de la rétine et permettre le retour à l’état de noirceur. L’une des étapes de ce processus est la phosphorylation de la rhodopsine par la rhodopsine kinase (GRK1). La GRK1 est une enzyme de 563 acides aminés ancrée aux membranes par son acylation en C-terminal. Une mutation au niveau de la sérine-536 mène à un changement du cadre de lecture et à l’absence d’acylation de la GRK1, ce qui cause la maladie d’Oguchi. L’hypothèse est que l’interaction de la GRK1 avec la membrane est modifiée par l’absence d’acylation, ce qui l’empêche d’interagir avec la rhodopsine. Le but du projet de recherche est de purifier une quantité suffisante de GRK1 non acylée et acylée pour permettre d’étudier leur interaction membranaire.

MATÉRIEL ET MÉTHODES : La séquence codante de la GRK1 a été clonée dans différents plasmides d’expression pour obtenir des protéines de fusion contenant diverses étiquettes en N terminal, soit MBP, His10-MBP et NusA-His10. La transformation de ces plasmides dans la souche E. coli BL21 DE3 RIPL a permis l’expression des protéines de fusion. Certaines de ces souches ont également été co-transformées avec un plasmide contenant les deux sous-unités de la farnésyltransférase, qui permet l’acylation de la GRK1. Après la surexpression de ces protéines de fusion, plusieurs méthodes de purification ont été utilisées en vue d’optimiser le rendement et la pureté de la GRK1.

RÉSULTATS : La GRK1 est soluble en fusion avec les étiquettes utilisées. La purification par chromatographie d’affinité a permis de séparer la GRK1 de la majorité des contaminants. Il reste cependant une étape importante à franchir qui consiste à séparer les formes non-acylée et acylée de la GRK1.

CONCLUSION : L’expression et la solubilité élevées des protéines de fusion devraient permettre d’atteindre les objectifs de ces travaux de recherche. Ces travaux devraient permettre d’obtenir les formes non-acylée et acylée de la GRK1 pure, ce qui permettra de procéder aux études de liaison membranaire.

TEST DE DÉCOLLEMENT POUR MESURER LA FORCE D’ADHÉSION DE LA JONCTION DERMO-ÉPIDERMIQUE D’UN MODÈLE DE PEAU RECONSTRUITE PAR GÉNIE TISSULAIRE


Alex Larose1,2, Angela Dakiw-Piaceski1,2, Martin Barbier1,2, Danielle Larouche1,2, Lucie Germain1,2
1Centre de recherche en organogénèse expérimentale de l'Université Laval/LOEX (Québec, Canada), et Département de chirurgie, Faculté de médecine, Université Laval 2Centre de recherche du CHU de Québec-Université Laval (Québec, Canada)

CONTEXTE ET OBJECTIFS: L’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (EBDR) est une maladie génétique rare due à la mutation du gène du collagène de type VII. L’EBDR se caractérise par une diminution de la force d’adhésion de la jonction dermo-épidermique (JDE) de la peau. La correction du gène défectueux par thérapie génique des cellules d’un patient souffrant d’EBDR et la fabrication de peaux reconstruites (PR) par génie tissulaire ouvrent la possibilité de produire une PR fonctionnelle pour la greffe autologue. L’objectif du projet était de développer un test mécanique capable de mesurer la force d’adhésion entre deux substrats de tissus organiques en vue de comparer la force de la JDE des différentes PR saines, mutées et corrigées. La force d'adhésion des PR saines a aussi été évaluée après 7, 10, 14 et 21 jours à l'interface air-liquide de la reconstruction des substituts.

MATÉRIEL ET MÉTHODES: Des PR saines et mutées ont été produites par la méthode d’auto-assemblage. Un emporte-pièce a été utilisé pour découper des échantillons des PR avec une largeur définie. L’épiderme a été séparé du derme sur une petite partie à l’aide de pinces pour permettre l’ancrage des deux couches, puis des tests de détachement par déplacement linéaire d’une cellule de charge de 10 N à vitesse constante selon une configuration en T ont été effectués à l’aide du système d’essais ElectroPuls E1000 d’Instron. Les mesures de force ont été analysées par un script MATLAB.

RÉSULTATS: La force d’adhésion moyenne des PR saines était de 6.4 mN/mm tandis que celle des PR mutées était de 1.1 mN/mm, avec une précision de ±0.5 mN. Une évolution significative a été observée entre la force d'adhésion des PR saines entre 7 et 21 jours d'interface air-liquide.

CONCLUSION: Nous avons mis au point un test mécanique capable de mesurer la force d’adhésion entre deux substrats organiques. Ce test permettra de comparer l’efficacité d’adhésion de la JDE suite à différents traitements pour corriger le gène défectueux des cellules de patients EBDR.

The role and effect of exosomes in corneal wound healing


Elodie Gillard 1,2, Camille Couture1,2,3,4, Gaëtan Le-Bel1,2,3,4, Lucie Germain1,2,3,4, Sylvain Guérin1,2
1CUO-Recherche, Médecine Régénératrice, Centre de recherche du CHU de Québec, Hôpital du Saint-Sacrement, CHU 2Département d’ophtalmologie, Faculté de médecine, Université Laval 3Département de Chirurgie, Faculté de médecine, Université Laval 4Centre de recherche en organogénèse expérimentale de l’Université Laval/LOEX, Médecine Régénératrice, Centre de recherche du CHU de Québec, Hôpital de l’Enfant-Jésus, CHU

CONTEXT and OBJECTIVES: The anterior position of the cornea predisposes it to chemical and physical injuries. Consequently, various complications can arise due to slow and impaired wound healing. It has been demonstrated that the addition of corneal mesenchymal stem cells (cMSCs) derived exosomes considerably accelerates wound closure in both in vitroscratch assay on human corneal epithelial cells (hCECs) and in vivoafter epithelial debridement in mice. It has later been demonstrated that the three major corneal cell types (epithelial, fibroblast and endothelial cells) release extracellular vesicles but their separate wound healing potential has yet to be determined. In order to define the contribution of these exosomes in the tissue healing process, exosomes derived from the three corneal cell types were isolated, characterised and their effects on other corneal cells were analysed.

METHODS:The size distribution of exosomes derived from the threedifferentcorneal cell types was determined through dynamic light scattering. The exosome morphology remained to be assessed by transmission electron microscopy. Exosomal concentrations of each samples were obtained using the EXOCET assay and compared. Furthermore, exosomes were isolated and quantified following scratch assay on each corneal cell type and compared to controls in order to determine whether cells produce more or less exosomes in wounded condition. Additionally, the effect of exosomes on cellular transcriptomic was examined by gene profiling and kinase array using the three types of corneal cells harvested after incubation with exosomes derived from the two other corneal cell types such that a culture flask of epithelial cells was incubated with endothelial cell derived exosomes and one with fibroblast derived exosomes. 

RESULTS:Preliminary results show that all three types of corneal cells seem to be releasing more exosomes in scratch condition during healing compared to controls. The rest of the results are still pending and will be presented. 

CONCLUSION:The next step will be to evaluate the wound healing potential of each corneal cell type derived exosomes by scratch assay on hCECs and eventually on human tissue-engineered corneas. The functional characterisation of corneal cells derived exosomes is essential to shedding light on the mechanisms of wound repair and may also provide a new therapeutic approach to accelerate healing in patients.

VERS UN TRAITEMENT PERMANENT DE L’ÉPIDERMOLYSE BULLEUSE DYSTROPHIQUE RÉCESSIVE PAR COMBINAISON ENTRE LA THÉRAPIE GÉNIQUE ET LE GÉNIE TISSULAIRE


Anabelle Demers11,3, Martin Barbier11,3, Angela Dakiw Piaceski11,3, Alex Larose1, Danielle Larouche1,3, Manuel Caruso2,3, Lucie Germain1,3
11Centre de recherche en organogénèse expérimentale de l'Université Laval/LOEX (Québec, Canada) et département de chirurgie, Faculté de médecine, Université Laval 22Centre de recherche sur le cancer de l'Université Laval (Québec, Canada) 33Centre de recherche du CHU de Québec-Université Laval (Québec, Canada)

CONTEXTE ET OBJECTIFS : L’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (EBDR) est une maladie génétique caractérisée par des décollements de la peau induits lors de stress mécaniques causant des ulcérations, d’importantes infections et pouvant aussi mener à une fusion des doigts et des orteils (pseudo-syndactylie). L’EBDR est causée par des mutations du gène COL7A1 codant pour le collagène de type VII (Col7) qui forme les fibrilles d’ancrages nécessaires à l’adhérence entre le derme et l’épiderme.  

 

La synthèse de substituts de peau à partir de cellules de patients modifiées génétiquement pour induire l’expression du Col7 et leur greffe subséquente a le potentiel d’offrir un traitement permanent des lésions cutanées des patients EBDR. L’objectif du projet est de transférer efficacement le gène COL7A1 dans les cellules de peau de patients et d’utiliser ces cellules pour produire des substituts cutanés ‘corrigés’.

 

MÉTHODES : Les cellules d’un patient EBDR ont été transduites par un vecteur SIN COL7A1 et utilisées pour produire des peaux reconstruites bi-lamellaires par la méthode d’auto-assemblage développée au LOEX. Les taux de transduction ont été déterminés par cytométrie en flux. La production de Col7 à la jonction dermo-épidermique (JDE) avant et après 28 jours de greffe sur souris athymique a été analysée par immunofluorescence. L’adhésion entre le derme et l’épiderme a été évaluée par des tests mécaniques de décollement.

 

RÉSULTATS : Jusqu’à 56% des fibroblastes et 70% des kératinocytes ont été transduits. Des peaux reconstruites bi-lamellaires ont été produites à partir des cellules transduites. Après 21 jours de culture à l’interface air-liquide, 60% des kératinocytes exprimant la kératine 19, un marqueur des kératinocytes souches, exprimaient aussi le Col7 a. De plus, une augmentation de la force d’adhérence entre le derme et l’épiderme a été mesurée dans les substituts de peau issus des cellules EBDR transduites comparativement aux non-transduites. Enfin, la présence de Col7 à la jonction dermo-épidermique a été observée par immunofluorescence après une greffe de 28 jours.

 

CONCLUSION : La méthode développée permet d’obtenir des taux élevés de transduction permettant de restaurer l’adhésion de l’épiderme au derme dans les substituts cutanés tout en conservant les cellules souches épidermiques. Il s’agit d’une avancée importante vers le traitement de l’EBDR.