Assessing the microbiome of a model cooling tower harboring Legionella pneumophila.
Adriana Torres Paniagua
Adaptation phénotypique de Pseudomonas aeruginosa au sein des biofilms
Alison Besse
Analyse fonctionnelle du fimbria Std chez Salmonella enterica sérovar Typhi
Karine Dufresne
Analysis of the genomic region of the sRNA lpr0024 uncovers a new mobile genetic element and a new endonuclease
Sebastien Faucher
Atténuation de la virulence et des biofilms de Pseudomonas aeruginosa in vivo via l'inhibition des nouvelles cibles
Irena Kukavica-Ibrulj
Au-delà de la A-layer: adsorption aux lipopolysaccharides et caractérisation de mutants résistants aux bactériophages spécifiques d'Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida.
Valerie E. Paquet
Caractérisation d’une nouvelle toxine RTX chez Escherichia coli
Rémi Dagès
Caractérisation fonctionnelle et structurale des transporteurs de nickel chez Helicobacter pylori
Mariem Chalbi
Characterization of two new SPATE autotransporters and cumulative role of SPATEs in pathogenesis of Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli
Pravil Pokharel
Création d’un outil bio-informatique convivial pour l’étude des changements d’acides aminés au cours de l'évolution des symbiotes bactériens.
Juan Guerra-Maldonado
Découverte de nouveaux traitements contre les infections à mycobactéries non tuberculeuses
Nowrin Hoque
Découverte et caractérisation de nouveaux ARN noncodants chez des bactéries du genre Burkholderia et Pseudomonas.
Aurélie Devinck
Deletion of the small regulatory RNA lpr10 increases the survival of Legionella pneumophila in water.
Joseph Saoud
Development of antibiotics with a high selectivity for N. gonorrhoeae and N. meningitdis
Robin Vidal
Dynamique du microbiome du tract intestinal d’un hôte confronté à des stress environnementaux
Judith Mogouong
Effet de mutations spontanées de gènes impliqués dans le quorum sensing du pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa : caractérisation de souches cliniques et environnementales.
Hélène Taillefer
Effets à long terme de l’élevage sur le microbiote du saumon atlantique (Salmo salar) après l’ensemencement en milieu naturel
Camille Lavoie
Étude de la diversité insoupçonnée de la bactérie Leptospira sp.
Antony Vincent
Études in vivo de la protéine TraC codée par le plasmide conjugatif pKM101 chez E. coli.
Jaafar Amro
Eukaryotic Community of Cooling Towers and its Relationship with the Pathogen Legionella pneumophila
Kiran Paranjape
Experimental evolution of Legionella pneumophila under heat stress
Jeffrey Liang
Expression et régulation du fimbria curli chez Salmonella enterica sérovar Typhi
France Daigle
Habiter une oasis acide dans un désert d’ions : le secret des communautés bactériennes des poissons Amazoniens
François-Étienne Sylvain
Identification de nouveaux mécanismes de régulation génique de la voie Gac/Rsm chez Pseudomonas aeruginosa
Charles Morin
Identification des protéines TAM-dépendantes chez Pseudomonas aeruginosa
Hamid Zeneba
Identification of a new series of quinazoline derivatives targeting the cytochrome bc1 in Mycobacterium tuberculosis
Andréanne Lupien
Identification of two aptamers binding to Legionella pneumophila
Mariam Saad
Implication des gènes codant pour curli dans l'auto-agglutination et la formation de biofilm dans la souche d'E. coli enterohémorragique Sakai
Yaindrys Rodriguez Olivera
Inhibition of Cagα, a T4SS ATPase required for Helicobacter pylori virulence
Claire Morin
Integrin-like tethering of motility complexes at bacterial focal adhesions
Salim Timo Islam
Je suis ce qu’ils mangent : les interactions hôte-microbiote et leur importance dans la santé métabolique et immunitaire des salmonidés d’élevage
Jeff Gauthier
L'enrobage de quatre bactéries différentes par deux protozoaires de type cilié du genre Tetrahymena
Alicia Durocher
La motilité sociale de type swarming, une pression sélective pour des mutants du quorum sensing chez le pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa
Sophie Robitaille
La polymyxine B en concentration sous-inhibitrice chez Vibrio choerae induit une inhibition de la formation de biofilm lié à une aflagellation des cellules
Sean Giacomucci
Le complexe TAM et son rôle dans la biogenèse des protéines membranaires chez les bactéries Gram-négatif
Jihen Ati
Les 4-hydroxy-3-méthyl-2-alkylquinolines pourraient-elles être impliqués dans la communication cellulaire et la virulence chez le complexe Burkholderia cepacia ?
Pauline Coulon
LES ADHESIONS FOCALES SUR LES BACTERIES LORS DU GLIDING SONT STABILISEES PAR DES ADHESINES ACCESSOIRES SURFACES DEPENDANTES
Nicolas JOLIVET
Les antimicrobiens modulent le Système de Sécrétion de Type VI de Vibrio cholerae
Candice Cros
L’adhésion de Caulobacter crescentus sondée à l’échelle moléculaire par microscopie à force atomique
Cécile Berne
L’importance du séquençage à longues lectures pour la caractérisation de génomes complexes tel que celui de l’agent pathogène Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida
Marie-Ange Massicotte
Modulation de la multicellularité bactérienne via différents polysaccharides sécrétés.
fares saidi
Optimisation de la production de rhamnolipides par la bactérie Burkholderia thailandensis par évolution dirigée
sarah martinez
Pan-génome de Pseudomonas aeruginosa : structure de population, le transfert horizontal des gènes et pathogénicité
Irena Kukavica-Ibrulj
Production et identification du biosurfactant inconnu de Burkholderia cenocepacia
Xavier Perron
Propriétés émergentes lorsque Pseudomonas aeruginosa et Burkholderia cenocepacia sont co-cultivés
May Landry
Rapid multicellular cell shape evolution: lesson form Neisseriaceae family
Sammy Nyongesa
Régulation des fimbriae de type 1 chez les Escherichia coli uropathogènes
Hicham Bessaiah
Rôle des toxines Stx dans la réponse d’Escherichia coli entérohémorragique O157:H7 à l’irradiation
Ghizlane Gaougaou
SalmoSeq, un outil moléculaire pour identifier rapidement la présence de Salmonella et prédire son niveau de virulence
Jean-Guillaume Emond-Rheault
Structure and localization of ESX-3 in Mycobacteria
Isabelle Morneau
Structure et mode d’action des transporteurs membranaires du nickel chez Helicobacter pylori
Imène Kouidmi
THE INFLUENCE OF TREHALOSE METABOLISM ON EXPRESSION OF TYPE I FIMBRIAE IN EXTRA-INTESTINAL ESCHERICHIA COLI STRAIN MT78
Dozois CM
Un composé capable de pénétrer et de tuer spécifiquement les Neisseria pathogènes
Eve BERNET
Un nouveau mécanisme de protection contre la recombinaison génétique anarchique chez Neisseria meningitidis ?
Martin Chenal
Une nouveau modèle de synthèse du peptidoglycane : le « stalk »
Maxime Jacq
UNMASKING KEY REGULATORS IN BACTERIAL HOST-TROPISM
Cecilia Nieves

Assessing the microbiome of a model cooling tower harboring Legionella pneumophila.


Adriana Torres Paniagua1, Kiran Paranjape1, Mengqi Hu2, Sebastien Faucher1
1McGill University 2Nankai University

Legionella pneumophila is a waterborne bacterium known for causing Legionnaires’ Disease, a severe pneumonia. Water systems, such as cooling towers, are major sources of infection, given that they provide ideal growth conditions and produce aerosols for its transmission to human. The conditions promoting growth in water systems are not well understood; however, it is known that Lp must grow inside host cells, such as amoebas and ciliates. More specifically, the relationship between L. pneumophila and the resident microbes needs to be clarified. Cooling towers that show high heterotrophic plate counts do not necessarily harbor L. pneumophila suggesting that such cooling towers could host a microbial population resistant to colonization by L. pneumophila. In addition, it is not clear where in the towers Lp preferentially grows. 

Therefore, we built a lab scale cooling tower model to study the dynamic of L. pneumophila colonization in relationship to resident microbiota and spatial distribution. The model was inoculated with water from an actual cooling tower harboring low levels of L. pneumophila. After a period of 8 weeks the model was seeded with Vermamoeba vermiformis, a natural host of Lp. After two more weeks the model was seeded with Lp. Presence of Lp was monitored every week by qPCR and LegiolertTM.   After two more weeks the model was disassembled, the water was collected and biofilm was extracted from the pipes. DNA was extracted and the microbiome was studied using 16S rRNA and 18S rRNA amplicon sequencing. 

The bacterial communities of the biofilm were different then the bacterial communities of the water samples. Interestingly, V. vermiformis and other ciliates were present in the biofilm but not in the water of the model. In contrast, L. pneumophila was detected in the water but not in the biofilm, suggesting that after growth in host cells Lp is released in the water phase.

Adaptation phénotypique de Pseudomonas aeruginosa au sein des biofilms


Eric Déziel1, Alison Besse1
1INRS-Institut Armand-Frappier

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste responsable de nombreuses infections chez les patients immunodéprimés et les individus atteints de fibrose kystique. Cette bactérie persiste grâce à sa capacité à former des biofilms qui la protègent des antibiotiques et de  la réponse immunitaire de l’hôte. Au sein des biofilms cliniques, P. aeruginosa possède un phénotype particulier qui se manifeste sous forme de colonies de type Small Colony Variant (SCV). Nos travaux ont permis d’observer le phénotype SCV chez des souches de P. aeruginosa provenant de divers environnements (sol pollué aux hydrocarbures, viande, éviers d’hôpitaux…) lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions particulières, démontrant que ce phénotype n’est pas associé exclusivement aux souches cliniques d’individus atteints de fibrose kystique. Des expériences avec la souche prototypique PA14 ont révélées que la formation de colonies SCV est favorisée à 37 degrés par rapport à une croissance à 30°C, suggérant que l’apparition de SCV pourrait être régulée par la température chez certaines souches. Grâce à un marquage fluorescent, nous avons observé que les colonies SCV forment plus rapidement un biofilm que les colonies sauvages. Ce résultat suggère que le phénotype SCV est impliqué dans la persistance bactérienne via la formation de biofilm, indépendamment de l’environnement colonisé. Le phénotype SCV est associé à de fortes concentrations du second messager c-di-GMP. Un criblage de souches mutantes pour les enzymes responsables de la synthèse et la dégradation de ce signal intracellulaire a mis en évidence trois mutants qui ne forment pas de SCV dans les conditions pourtant favorables à leur présence. Ces gènes pourraient être impliqués dans l’apparition du phénotype SCV. Ce travail est le premier a montré une omniprésence du phénotype SCV chez des souches P. aeruginosa non isolées de patients infectés. L’ensemble des résultats obtenus suggèrent que le phénotype SCV pourrait être une stratégie de diversification phénotypique adoptée par P. aeruginosa pour s’adapter rapidement et persister dans les environnements qu’elle colonise, ce qui expliquerait son ubiquité.

Mots clés : Pseudomonas aeruginosa, biofilm, Small colony variant

Analyse fonctionnelle du fimbria Std chez Salmonella enterica sérovar Typhi


Karine Dufresne1, France Daigle1
1Université de Montréal

Salmonella enterica sérovar Typhi est l’agent étiologique de la fièvre typhoïde, une maladie contractée par plus de 20 millions d’humains annuellement et mortelle dans 1% des cas. Pour infecter spécifiquement l’humain, S. Typhi possède une variété de facteurs de virulence dont une capsule lui permettant de s’évader du système immunitaire de l’hôte et une toxine ciblant seulement les cellules humaines. Un autre élément pouvant expliquer sa spécificité d’hôte est son répertoire unique de 14 différents systèmes d’adhésion appelés fimbriae. Parmi ceux-ci, 12 fimbriae sont de type chaperon-placier. Dans notre laboratoire, nous croyons que ces fimbriae participent à la spécificité d’hôte de S. Typhi. Parmi ces fimbriae, nous retrouvons 7 systèmes qui sont communs à S. Typhi et S. Typhimurium, un sérovar à large spectre d’hôte causant la gastroentérite. Un des fimbriae très étudiés chez ce sérovar généraliste est Std qui est important dans la persistance intestinale chez la souris. Dans nos travaux précédents, nous avons démontré que ce fimbria est produit à la surface de S.Typhi et qu’il est très fortement exprimé au niveau de son promoteur. Nous avons aussi noté que Std démontrait une grande différence d’expression entre S.Typhi et S.Typhimurium. Le but de cette étude est de caractériser les mécanismes de régulation du fimbria Std chez S.Typhi. 

Nous avons identifié des régulateurs du promoteur de l’opéron stdpar deux approches, c’est-à-dire soit en ciblant directement des gènes régulateurs d’intérêt ou en criblant une banque de mutants par insertion de transposon. La première approche consiste à muter le gène du régulateur d’intérêt par mutagenèse par échange allélique, puis d’y insérer notre vecteur d’expression où le promoteur est fusionné à lacZ sur un plasmide multi-copie pour procéder à un essai d’expression de la ß-galactosidase. Cela nous a permis d’identifier plusieurs régulateurs de Std  tels que Crp, PhoP et Lrp comme activateurs et FlhCD et OmpR comme inhibiteurs. 

Pour ce qui est du criblage, nous avons créé une banque de mutants par insertion du transposon Tn5 dans laquelle nous avons transformé notre plasmide d’expression. Puisque Std est fortement exprimé, il y a production de colonies rouges sur le milieu différentiel MacConkey, donc nous avons criblé la banque pour les colonies blanches. Nous avons identifié une cinquantaine de colonies. Le site d’insertion des transposons est ensuite identifié par séquençage et l’effet de la mutation est confirmé par essai ß-galactosidase en comparaison à la souche sauvage. Dans ce criblage, plusieurs facteurs ont démontré un effet régulateur sur le promoteur de std tels que SodB, le fimbria Bcf et les systèmes à deux composantes CitBC et PhoPQ. Ces gènes ont été délétés et leur rôle de régulateur de Std a aussi été confirmé par essai d’activité ß-galactosidase.

En déterminant les conditions d’expression des fimbriae à la surface de la bactérie, un vaccin plus efficace visant ces structures pourrait être élaboré. Les fimbriae seraient possiblement aussi de bonnes cibles pour des antimicrobiens visant l’inhibition de la virulence plutôt que la mort bactérienne, ce qui diminuerait la pression de sélection pour une résistance bactérienne. À la vue de la variété des fimbriae chaperon-placier et de la variation de leur expression entre sérovars, les fimbriae ont possiblement un rôle à jouer dans la spécialisation de S.Typhi pour l’hôte humain.

Analysis of the genomic region of the sRNA lpr0024 uncovers a new mobile genetic element and a new endonuclease


Malak Sadek1, Sebastien Faucher1
1McGill University

Legionella pneumophila (Lp) is a facultative intracellular pathogen and it is the causative agent of Legionnaires disease (LD), an acute form of pneumonia, and Pontiac fever, a milder flu-like illness. Lp is commonly found in natural freshwater bodies as well as in the engineered water systems and man-made water distribution systems such as cooling towers. Free-living amoeba in aquatic environments are the primary reservoir for Lp, but it can be transmitted to human’s lung by inhalation of contaminated aerosols. Upon entry into the human’s lung, Lp can infect and replicate inside alveolar macrophages and potentially cause LD in susceptible individuals. It has been shown that genetic mobile elements may enhance the versatility of Lp and that they are major players in genome plasticity. It is believed that Small Regulatory RNAs (sRNAs) are major players of regulation of virulence-related genes in Lp. sRNAs are classified into cis or trans encoded sRNAs that modulate gene expression through complementarity to their adjacent or distant mRNA targets, respectively.

We investigated the role of the trans-encoded sRNA lpr0024 encoded between iraB and lpg0745. This sRNA is expressed in both exponential and post exponential phases. Inspection of the genomic region revealed that the sRNA is present in several copies and identified a previously unannotated ORF with a putative endonuclease function at the 3’ side of the sRNA. An additional partial sRNA copy is encoded on the other side of the ORF. The repeated sequences suggest recombination and possibly variation in the copy numbers of the sRNA. PCR analysis and sequencing of the amplicons confirmed that the number of copies of the sRNA varies between 1 and X at the population levels. Finally, we showed by PCR that recombination events leads to the excision of this region. The episome contains several copies of the sRNA as well as the ORF. In conclusion, we have discovered a new MGE in Legionella that encodes a sRNA and an endonuclease. The role of the sRNA and the ORF will be investigated further.

 

Atténuation de la virulence et des biofilms de Pseudomonas aeruginosa in vivo via l'inhibition des nouvelles cibles


Fadi Soukarieh1, Tomas Sou2, Mirko Iubatti3, Irena Kukavica-Ibrulj4, Eduard Vico1, Nigel Halliday1, Christel A.S. Bergström2, Michael J. Stocks1, Peter E. Nielsen3, Paul Wiliams1, Roger C. Levesque4, Miguel Cámara1
1School of Life Sciences, Centre for Centre for Biomolecular Sciences, University of Nottingham, Nottingham, UK 2Department of Pharmacy, Uppsala University, Uppsala, Sweden 3Department of Cellular and Molecular Medicine, Panum Institute, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark 4Institut de biologie intégrative et des systèmes (IBIS), Université Laval, Québec City, Canada

Les stratégies thérapeutiques traditionnelles ciblant la destruction bactérienne causent souvent une pression sélective forte résultant en l’émergence rapide de la résistance bactérienne aux antimicrobiens. Une approche alternative serait d’inhiber la virulence bactérienne. Chez Pseudomonas aeruginosa la virulence est contrôlée par une régulation génétique fine via la communication coordonnée entre les cellules bactériennes et appelé ‘’quorum sensing’’ (QS) par des molécules diffusées dans le mieux externe.

 

L’objectif principal de la présente étude consiste à l’optimisation des composés chimiques et des acides nucléiques couplés aux peptides (peptide nucleic acids, PNAs) ciblant la biosynthèse et l’inhibition de la régulation du signal de la communication inter-bactérienne chez le Pseudomonas appelé ‘’Pseudomonas Quinolone Signal’’ (PQS). Ces petites molécules inhibitrices rendent les bactéries non seulement moins virulentes et diminuent également la production de biofilm facilitant ainsi l’activité des antibiotiques.  

 

Ce projet regroupe des experts dans la synthèse chimique et des PNAs, pour la formulation pharmacologique et pour l’évaluation in vivo dans des modèles animaux de l’infection pulmonaire chronique. Ces inhibiteurs du QS ont été conçus par la modélisation structure-fonction en tentant de maximiser et d’optimiser leur activité. Les propriétés physico-chimiques des inhibiteurs ont été optimisées pour le maximum de solubilité et un minimum de toxicité.

Plusieurs composés démontraient un excellent potentiel inhibiteur in vitro de l’activité QS et une diminution de la production des chromophores comme la pyocyanine et du biofilm.

 

Certains inhibiteurs démontraient un effet synergique lorsque utilisés en combinaison avec les antibiotiques ou les PNAs. Des résultats prometteurs ont été obtenus in vivo avec  les inhibiteurs QS moins toxiques en combinaison avec la Tobramycine. Les inhibiteurs du QS les plus prometteurs développés laissent entrevoir un fort potentiel thérapeutique  pour le traitement de d’autres infections causées par P. aeruginosa.

Au-delà de la A-layer: adsorption aux lipopolysaccharides et caractérisation de mutants résistants aux bactériophages spécifiques d'Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida.


Valerie E. Paquet1,2,5, Antony T. Vincent3, Sylvain Moineau4,5, Steve J. Charette1,2,5
1Institut de biologie intégrative et des systèmes, IBIS 2Institut universitaire de cardiologie et pneumologie de Québec 3INRS-Institut Armand-Frappier 4Groupe de recherche en écologie buccale, GREB 5Département de biochimie, microbiologie et bio-informatique de l'université Laval

L’aquaculture est une production agroalimentaire qui fournit plus de 75% des poissons d’eau douce consommés à travers le monde. Dans les bassins d’élevage, les poissons subissent des stress qui engendrent des maladies causant ainsi de grandes pertes économiques chez les producteurs. La bactérie Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida (A. sal.) est l’agent étiologique de la furonculose chez les salmonidés. Le traitement de cette maladie se fait présentement par antibiotique ou par vaccination. Malheureusement, A. sal.est souvent porteuse de plusieurs résistances aux antibiotiques et les méthodes actuelles de vaccination sont habituellement exigeantes et peu efficaces. Le recours à des traitements alternatifs s’impose. Les bactériophages, virus qui infectent spécifiquement les bactéries, sont une avenue envisagée pour traiter la furonculose en aquaculture. Plusieurs bactériophages, dont certains nouvellement isolés dans des piscicultures québécoises, ont montré un grand pouvoir lytique face à plus de 65 isolats d'A. sal. et l'analyse de leurs génomes suggère leur innocuité dans un but thérapeutique. Or, dans un contexte de phagothérapie, il est essentiel de comprendre les mécanismes de résistance bactérienne face aux bactériophages. Dans ce projet, les phénotypes et les génotypes de mutants résistants à la lyse des bactériophages spécifiques d'A. sal. ont été analysés. Cela a permis de mieux comprendre les mécanismes d'adsorption des bactériophages au niveau des récepteurs bactériens, les lipopolysaccharides, et de clarifier le rôle de la A-layer, une protéine de surface chez A. sal., comme couche protectrice contre les bactériophages. Ces travaux fondamentaux sont la base d’expérimentations futures chez les poissons infectés par A. sal. qui auront lieu dans les nouvelles installations du Laboratoire aquatique de recherche en sciences environnementales et médicales (LARSEM). À plus long terme, nous souhaitons pouvoir offrir un traitement par les bactériophages contre la furonculose dans les piscicultures québécoises d’une façon alternative ou concomitante aux traitements classiques.

Caractérisation d’une nouvelle toxine RTX chez Escherichia coli


Rémi Dagès1, Joseph Saoud1, Hajer Habouria1, Sébastien Houle1, Charles M. Dozois1, Amélie Garenaux1
1INRS-Institut Armand-Frappier

Escherichia coli est une bactérie commensale qui colonise l’intestin et fait partie du microbiote normal chez les humains. Cependant, certaines souches ont la capacité de causer des infections entériques et extra-intestinales. Ces souches associées aux infections systémiques comprennent le pathotype ExPEC (extra-intestinal pathogenic E. coli) qui possède plusieurs mécanismes de virulence dont l’un est la production de toxines.

Notre laboratoire a identifié, un nouveau système de toxine de type RTX (Repeats in Toxin). Ces toxines ont une activité cytolytique et hémolytique formant des pores dans les membranes des cellules cibles. La nouvelle toxine a été trouvée chez une souche pathogène aviaire (avian pathogenic E. coli-APEC) et chez certaines souches ExPEC d’infections humaines. Le système a été nommé toxine Prt (Pre-repeats in toxin). L’analyse des séquences génomiques a montré que PrtC code pour un acyl-transférase, PrtA code pour un précurseur de la toxine (qui est activé par l’acétylation par PrtC), PrtB et PrtD codent pour le transfert de la toxine dans le milieu extracellulaire.

Des analyses de production de la toxine ont été déterminées par Western blot en utilisant des anticorps spécifiques contre cette toxine. Cela a mis en évidence que la toxine Prt est sécrétée dans le milieu extracellulaire. Couplés aux résultats de tests d’hémolyse sur sang liquide de différentes espèces vivantes, cela a démontré que l’opéron entier est nécessaire à la production d’une toxine fonctionnelle et que cette toxine affectait des espèces en particulier. L’importance du système Prt pour la virulence et la colonisation chez la volaille a été étudiée via des expériences in vivo sur un modèle aviaire. Les résultats montrent que l’absence des gènes prt entraîne une survie des poussins après 48h d’infection. De plus, les décomptes bactériens dans le sang et les organes des animaux infectés étaient moins importants pour les souches ne possédant pas les gènes prt. Une meilleure connaissance et compréhension des mécanismes impliqués dans la virulence pour cette nouvelle toxine de la famille des RTX, permettra potentiellement le développement de système de défense afin de réduire les pertes dans le domaine aviaire ou autres, touchés par des souches d’Escherichia coli produisant des toxines appartenant à la famille des RTX.

Caractérisation fonctionnelle et structurale des transporteurs de nickel chez Helicobacter pylori


Mariem Chalbi1, Michel Lê1,2, Imène Kouidmi1, Charles Calmettes1
1INRS-Institut Armand-Frappier 2Université de Montréal

L’acquisition des métaux est indispensable à la survie et à la virulence de plusieurs bactéries notamment chez Helicobacter pylori. Il s’agit du seul pathogène capable de coloniser la niche gastrique, infectant la moitié de la population humaine, et causant diverses pathologies telles que les ulcères et les cancers gastriques. Le traitement de l’infection par H. pylori est une combinaison d’antibiotiques et de sels de bismuth. L’un des plus importants ions métalliques chez H.pylori est le nickel qui est considéré comme un déterminant de virulence chez ce pathogène. En effet, cette bactérie nécessite le nickel comme co-facteur catalytique de deux enzymes clefs de son adaptation à la niche gastrique qui sont l’uréase et l’hydrogénase. Cependant, le nickel est un élément rare dans le corps humain, H. pylori nécessite donc des mécanismes d'acquisition hautement spécifiques et efficaces.

Le nickel est transporté à l’intérieur de cette bactérie par la perméase NixA et le système NiuBDE, possédant des systèmes de régulation propres. Le système NiuBDE est composé de deux protéines périplasmique, NiuB1 et NiuB2, et d’un transporteur ABC composé de NiuD et NiuE logé dans la membrane interne. Ce système a récemment été impliqué dans le transport des sels de bismuth utilisés chez l’humain pour éradiquer le pathogène. Nous visons à étudier le système de transport NiuBDE et plus particulièrement les navettes périplasmiques NiuBs. Mes travaux visent à caractériser la structure des transporteurs NiuBs et à déterminer leur rôle dans le transport du nickel et des sels de bismuth par des études structurales (cristallographie aux rayons-X). A terme cette étude contribuera à l’amélioration des connaissances scientifiques sur le mécanisme de transport des ions nickel chez H. pylori et permettra l’établissement de nouvelles stratégies pour améliorer l'efficacité des traitements anti-H. pylori.

Characterization of two new SPATE autotransporters and cumulative role of SPATEs in pathogenesis of Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli


Pravil Pokharel1,2, Segolène Maris1, Charline Herscher1, Noëmie Fessy1, Sebastien Houle1,2, Charles M. Dozois1,2
1INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Quebec, Canada 2CRIPA-Centre de recherche en infectiologie porcine et avicole, Saint-Hyacinthe, Quebec, Canada

Serine protease autotransporters of Enterobacteriaceae (SPATE) are associated with various pathogenic extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) including avian pathogenic E. coli (APEC). We have identified two new genes encoding SPATE proteins, located adjacent to each other on a genomic island in an APEC strain (5 SPATES in total), and we refer to them as “tandem autotransporter genes, tagB, and tagC”. Interestingly, these autotransporter genes are present in some APEC and also some human uropathogenic E. coli (UPEC). The possible function and roles of these new SPATES in the pathogenesis of ExPEC were investigated.

 

Clones of these proteins were tested for various phenotypes including adherence to human renal and bladder cell lines, biofilm formation, autoaggregation, cytotoxicity and hemagglutination, which represent possible mechanisms of colonization of the host. Results showed that these SPATEs are autoaggregating and can promote adherence to the HEK 293 renal and 5637 bladder cell lines, but did not contribute significantly to biofilm production or hemagglutination. TagB and TagC exhibited cytopathic effects on the bladder epithelial cell line. Following transurethral infection of CBA/J mice with a tagBC mutant, no significant difference in colonization was observed. However, the competitive fitness of a mutant derivative lacking all 5 SPATEs was significantly lower in the kidney. This underlines the potential cumulative role of SPATEs for survival and competitive fitness during extra-intestinal infection.

Création d’un outil bio-informatique convivial pour l’étude des changements d’acides aminés au cours de l'évolution des symbiotes bactériens.


Juan Guerra-Maldonado1, Frederic veyrier1
1INRS-Institut Armand-Frappier

Le laboratoire Veyrier étudie l'adaptation des symbiotes bactériens à leurs différents hôtes. Nos modèles d’études sont, entre autres, les mycobactéries comme M. tuberculosis, les Neisseriaceae comme N. meningitidis ou les Leptospires comme L. interrogans. Afin de décrire les changements qui ont permis leur émergence, nous avons d’abord développé un outil bioinformatique appelé MycoHit. Il effectue des comparaisons génomiques par Blast et permet la détection de l'insertion ou de la délétion de gènes au cours de l'évolution de symbiotes spécifiques. Malgré que nous ayons souligné plusieurs fois l’importance de tels changements dans l’évolution de bactéries, nous avons observé qu’ils ne sont pas suffisants pour expliquer complètement certains changements phénotypiques. En effet, nous avons émis l’hypothèse que, dans certains cas, ceux-ci doivent être accompagnés de changements plus subtils tels que des changements d'acides aminés pouvant altérer partiellement les fonctions de certaines protéines conservées. Nous avons donc amélioré notre outil pour pouvoir détecter, à large échelle, les changements d’acides aminés et leur sélection au cours de l’évolution des symbiotes bactériens. Nous avons produit un programme convivial implémenté dans Perl, JAVA et MySQL et maintenant nous l’appliquons  afin de mieux comprendre l'évolution de l'enveloppe cellulaire chez plusieurs bactéries incluant des symbiotes pathogènes. Il ne fait aucun doute que l'identification de ces événements pourrait révéler un nouveau mécanisme physiologique bactérien.

Découverte de nouveaux traitements contre les infections à mycobactéries non tuberculeuses


Nowrin Hoque1,2,3, Chris Walpole4,5, Aled Edwards5,6, Marcel A. Behr1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, McGill University 2The Research Institute of the McGill University Health Centre 3McGill International TB Centre 4Structure-guided Drug Discovery Coalition 5Structural Genomics Consortium 6Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Les mycobactéries non tuberculeuses (MNT) sont des bactéries pathogènes opportunistes qui provoquent une maladie pulmonaire chronique, semblable à la tuberculose (TB). Au fil des années, il y a eu une augmentation du nombre de cas de MNT au Canada ainsi que chez le reste du monde. Les patients présentant des lésions pulmonaires préexistantes et les hôtes immunodéprimés ont une susceptibilité accrue à ces infections. Une des espèces la plus importante est le Mycobacterium abscessus, ayant l'impact le plus néfaste sur la fonction pulmonaire des patients.

Le taux de succès des traitements contre M. abscessus est faible (50% ou moins) par rapport à la TB (plus de 95%) dû à leur résistance intrinsèque à de nombreux médicaments antituberculeux. Les régimes thérapeutiques actuels sont longs (12-24 mois) et la toxicité associée au traitement est considérable. Malgré les résultats médiocres de la thérapie, la découverte de médicaments contre les MNT est limitée. Cette étude vise à découvrir de nouveaux médicaments contre M. abscessus. Notre hypothèse est que de nouveaux composés contre les cibles antituberculeux offrent la voie la plus directe à la découverte de nouvelles thérapies antimicrobiennes contre les MNT. Nous avons évalué l'essentialité de la nouvelle cible antituberculeuse dihydrofolate réductase (DHFR) à l’aide d’une combinaison de CRISPRi et d'inhibition chimique.

Lors des expériences préliminaires, la méthodologie CRISPRi a d'abord été validée chez l'organisme modèle M. smegmatis, puis chez M. abscessus. Avec cette technique, le gène DHFR, dfrA, s'est révélé essentiel pour la croissance in vitro de deux sous-espèces de M. abscessus. Une série d'inhibiteurs candidats de la DHFR a été testée pour l'inhibition de la croissance in vitro en utilisant la microdilution en bouillon et la méthode de dilution en gélose conventionnelle. Quelques composés testés ont eu une activité antimicrobienne signifiante contre M. abscessus (CMI 90 à 10 μM ou moins).

Les données obtenues suggèrent que la DHFR peut constituer une cible médicamenteuse prometteuse pour les infections à MNT. Les études en cours visent à déterminer si l’utilisation d’inhibiteurs de la pompe d’efflux peut potentialiser l’activité de nos candidats inhibiteurs de la DHFR. La validation de cette cible chez une autre espèce de MNT, cliniquement pertinente, M. avium, est également à l’étude.

Découverte et caractérisation de nouveaux ARN noncodants chez des bactéries du genre Burkholderia et Pseudomonas.


Aurélie Devinck1, Emilie Boutet1, Jonathan Ouellet1, Balasubramanian Sellamuthu1, Rihab Rouag1, Vesta Korniakova1, Mohammad Reza Naghdi1, Jonathan Perreault1
1INRS-Institut Armand Frappier

Au cours des dernières décennies, de nouvelles classes d’ARN ont été découvertes ne comprenant pas d’informations destinées à la synthèse des protéines, mais ayant une fonction régulatrice, ceux-ci ont un rôle important dans l’adaptation des bactéries à leur environnement. Ce sont les ARN noncodants (ARNnc) qui peuvent être des ARN antisens, des petits ARN régulateurs et des riboswitchs. Ces derniers sont des molécules d’ARN le plus souvent retrouvées dans la partie 5′ non traduites des ARN messagers. Ils agissent comme des récepteurs et permettent, suite à la liaison spécifique de leur ligand, de réguler l’expression du gène situés directement en aval de celui-ci soit au niveau de la transcription, soit au niveau de la traduction.

De nombreux riboswitchs ont déjà été découverts dans presque toutes les espèces bactériennes étudiées, mais les limites des approches bioinformatiques comme l’impossibilité de trouver des motifs chevauchant les séquences codantes, la nécessité d’avoir des alignements montrant de la covariation ou le fait que les motifs trop simples ne seront pas considérés rend difficile la découverte de nouveaux riboswitchs.

Nous avons développé une technique, le Shifted-Reverse PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (SR-PAGE), pour trouver des riboswitchs présentement non-détectables par les méthodes bioinformatiques. Des librairies d’ADN génomique ont été créées comportant une vingtaine de bactéries incluant Pseudomonas aeruginosa et Burkholderia thailandensis, qui seront utilisées via la méthode de SR-PAGE pour découvrir de nouveaux riboswitchs. Les riboswitchs candidats seront évalués in vitro par la méthode in line probing et in vivo avec des gènes rapporteurs. À cet effet, nous avons développé un vecteur qui permet d’étudier in vivo des ARNnc. D’ailleurs, l’essai développé avec ce vecteur est aussi utilisés pour comprendre plusieurs ARNnc potentiels chez des bactéries pathogènes du genre Burkholderia et Pseudomonas, mais qui n’avaient pas été caractérisés jusqu’à maintenant. Nos travaux pourraient avoir un impact important selon les gènes qu’ils régulent, notamment comme cibles pour de potentiels futurs antibiotiques.

Deletion of the small regulatory RNA lpr10 increases the survival of Legionella pneumophila in water.


Joseph Saoud1, Sebastien Faucher1
1McGill University

Introduction: Legionella pneumophila(Lp) is the causative agent of a fatal pulmonary infection known as Legionnaires’ disease. This pathogen infects human hosts through the inhalation of contaminated aerosols that are mainly generated from water distribution systems. Once inside the lungs, Lpinfects and grows within alveolar macrophages. The Type IVb secretion system is the most important virulence factor of Lp. In recent years, small regulatory RNAs (sRNAs) have been identified as important regulators of virulence and other cellular functions. While more than 70 small regulatory RNAs (sRNA) have been identified in L. pneumophila, only a few of them have been studied and characterized. 

 

Objective: The objective of this study is to understand how the known sRNAs are regulated and to identify their function. Lpr10 was selected because it is expressed during the post exponential phase, which mimics the transmissive phase during infection. 
 

Results:  Expression profiles of this sRNA were analyzed in mutants of known virulence regulators. Lpr0010 is regulated by RpoS, RelA, SpoT, and CpxR. Since Lpr10 is differentially expressed during Lp’s growth phase, a mutant was constructed for further characterization. The mutant showed similar intracellular growth in THP-1 human macrophages than the wild-type. The lpr0010mutant was able to survive longer in water at 25°C which suggests that it represses genes involved in this condition. The mutant strain’s transcriptome was then analyzed by microarray and the results were confirmed by qPCR. RpoS, the sigma factor required to survive various stresses, including survival in water, and necessary for the switch from replicative phase to the transmissive phase is upregulated in the lpr10mutant. Finally, a putative binding site for Lpr10 was identified upstream of rpoS. 

 

Conclusion: Lpr10 mediated control of RpoS expression likely facilitate the switch between transmissive phase back to replicative phase, which is necessary for maximum growth inside cells. The mechanism will be further studied by western blot and by analyzing the stability of the rpoSmRNA in the wild-type and lpr10mutant. 
 

Development of antibiotics with a high selectivity for N. gonorrhoeae and N. meningitdis


Robin Vidal1, Marthe Lebughe 1, Eve BERNET1, Golara Golbaghi1, Mehdi Haghdoost1, Frederic veyrier1, Annie Castonguay1
1INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada

There is a need to develop novel avenues to selectively treat bacteria that are becoming increasingly resistant to currently used antibiotics. For instance, vaccines and antibiotics are currently minimally preventing a devastating global epidemic but unfortunately, some bacterial strains are rapidly evolving to escape those two types of human interventions. Notably, Neisseria gonorrhoeaea sexually transmitted infection considered as an emerging public health threatwith no vaccine available, a high morbidity and the fact that it is resistant to more and more antibiotics such as cefixime, ceftriaxone, or erythromycin.2,3 In collaboration with microbiologists from our institute, we recently found that some organoborates are highly effective at selectively inhibiting the growth and at killing Neisseria gonorrhea and Neisseria meningitidis. The aim of our study is then to develop novel a new family of antibiotics with a comparable or higher activity than currently used therapeutics for the treatment of infections caused by the two above-mentioned pathogenic bacteria from the Neisseria family but importantly, that do not alter the activity of other bacteria (including non pathogenic Neisseria) that constitute the normal flora in healthy individuals and contribute to prevent other potential infections. In this presentation, strategies adopted for the preparation of a variety of organoborates will be reported. Moreover, results from a preliminary structure-activity screening against the two pathogens of interest will be discussed, including the influence of their respective lipophilicity on the ability ot the compounds to internalize bacteria, as determined by logP determination and ICP-MS experiments. Results emerging from this study could lead to the development of novel strategies for the design of highly selective treatments for these pathogens that are becoming serious human threats.

 

1. Tacconelli, E.; Magrini, N. Global priority list of antibiotic-resistant bacteria to guide research,

discovery, and development of new antibiotics, Geneva: WHO, 2018.

2. Lefebvre, B.; Martin, I.; Demczuk, W.; Deshaies, L.; Michaud, S.; Labbé, A.C.; Beaudoin, M. C.;

Longtin, J. Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae, Canada, 2017. Emerg Infect Dis. 2018, 24,

381.

3. Unemo, M.; Jensen, J. S. Antimicrobial-resistant sexually transmitted infections: gonorrhoea and

Mycoplasma genitalium. Nat Rev Urol. 2017,14,139.

Dynamique du microbiome du tract intestinal d’un hôte confronté à des stress environnementaux


Judith Mogouong1, Philippe Constant1, Robert Lavallée2, Claude Guertin1
1INRS-Institut Armand-Frappier 2Ressources Naturelles Canada

L’agrile du frêne est un insecte exotique originaire d’Asie du Sud-Est, qui est associé à des dommages environnementaux et économiques considérables en Amérique du Nord. Les organismes eucaryotes sont réputés vivre en association avec des communautés microbiennes qui leurs sont associées (microbiote) et qui pour certaines auraient des rôles importants en lien avec des fonctions métaboliques de l’hôte, notamment des fonctions liées aux capacités d’adaptation de face à des facteurs environnementaux variables. Les stress environnementaux sont susceptibles d’induire des mécanismes de défense au niveau des arbres, notamment l’attaque par des herbivores, des changements physiologiques tels que les changements phytochimiques au niveau des feuilles et du phloème. En conséquence, cela peut affecter le comportement de l'insecte herbivore au moment de son établissement. Le but de cette étude est d’étudier la dynamique du microbiote intestinal des insectes lorsque l’arbre hôte est soumis à des stress environnementaux. Ainsi, insectes ont été capturés en utilisant les pièges Lindgren©installés sur des frênes. Un gradient de la population d'insectes a ainsi été obtenu après une collecte effectuée le long du fleuve St-Laurent, permettant de créer trois niveaux de stress (lié à l’état de l’arbre). L'ADN microbien total extrait du tract intestinal a été envoyée pour le séquençage d’amplicons avec la technologie Illumina MiSeq paired-end ciblant le gène codant pour la région 16S pour les communautés bactériennes de l’ARNr et la région ITS2 pour les communautés fongiques. Les premiers résultats permettent de suggérer une variation significative tant au niveau de la richesse spécifique que de la diversité (Indices Chao1 et Simpson). Un profil global bactérien et fongique basé sur les nouvelles techniques de séquençage a été identifié pour la première fois, depuis la détection de cet insecte ravageur en Amérique du Nord. Une analyse de coordonnées principales (PCoA) basée sur des distances Bray Curtis a permis de confirmer une variation significative pour les communautés bactériennes (PERMANOVA, p-value=0,0042, R2= 0,39) en fonction du niveau de stress de l’arbre hôte. Les travaux en cours permettront d’établir des corrélations entre la dynamique des microbiome intestinal de l’insecte et des paramètres intrinsèques à l’arbre notamment ceux relatifs à la phytochimie des feuilles. Ces avancements devraient permettre d’avoir une meilleure compréhension de la stratégie d’établissement de l’insecte sur les arbres nouvellement infestés et d’adapter les stratégies visant à lutter contre cet insecte.

Effet de mutations spontanées de gènes impliqués dans le quorum sensing du pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa : caractérisation de souches cliniques et environnementales.


Hélène Taillefer1, Sara Habouria1, Eric Déziel1
1INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Québec.

Principalement retrouvé chez les patients atteint de fibrose kystique, Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste humain prévalent notre environnement. Grâce à trois systèmes de communication intercellulaire,  cette bactérie à Gram-négatif est capable de moduler sa virulence par la densité de sa population, ce qu’on appelle le quorum sensing (QS). Le QS de P. aeruginosa permet l’amplification et la coordination de l’expression des gènes de virulence en activant leur transcription.  Les systèmes de QS Las/Rhl sont basé sur des signaux moléculaires de type N-acyl-homoserine lactone (AHL), produits par les synthases LasI et RhlI. Le régulateur transcriptionnel LasR est activé dès le début de la vie de la bactérie, il permet le contrôle de l’expression de plusieurs gènes tels que lasA, lasB, aprA, toxA, mais aussi l’expression des gènes lasI et rhlI, induisant  une boucle de rétroaction positive et l’activation du 2e système de QS à base de AHL chez P. aeruginosa : RhlR. Des souches mutantes pour le gène lasR sont fréquemment isolées parmi des souches cliniques de
P. aeruginosa (infections aigue ou chroniques), surtout chez les individus chroniquement colonisés par cette bactérie. La prévalence de tels mutants dans d’autres environnements est essentiellement inconnue. Récemment, nous avons isolé d’autres souches mutantes lasR- provenant d’échantillons environnementaux (viandes et poissons de marchés alimentaires, sols contaminés aux hydrocarbures, etc.). On reconnait entre autre qu’un mutant lasR- a une incapacité de croitre sur la caséine, le système de QS las étant le principal régulateur de la production de protéases extracellulaires (telle LasB). On sait que certains de ces mutants sont des «Social Cheaters» qui  exploitent le «bien public» (dans ce cas-ci, les protéases extracellulaires) produit par les autres bactéries. Cependant, certains de ces mutants lasR semblent tout de même capables de produire les protéases dégradant la caséine.   En effet, le système RhlR contrôle également la production de la protéase LasB. Cependant, l’activation de ce système est normalement sous le contrôle du système LasR, via la régulation de rhlI, suggérant une activation indépendante ou une sur-expression du système RhlR. Nous étudions différentes souches mutantes de P. aeruginosa  isolées à partir d’échantillons cliniques et environnementaux en vue de comprendre ces différents résultats : mesure d’activité protéolytique et notamment l’utilisation de la caséine par les souches mutantes ; suivis de la production d’AHL, au cours de la croissance bactérienne ;études des différences de mutations du gène lasR, etc.

Effets à long terme de l’élevage sur le microbiote du saumon atlantique (Salmo salar) après l’ensemencement en milieu naturel


Camille Lavoie1,2, Nicolas Derome1,2
1Département de Biologie, Université Laval 2Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes (IBIS), Université Laval

Au Québec, les populations du saumon atlantique (Salmo salar) font face à un déclin sans précédent depuis les deux dernières décennies. Pour y remédier, les instances gouvernementales font appel à plusieurs mesures de remédiation, dont l’ensemencement. Cette méthode consiste à élever un nombre important de juvéniles en pisciculture avant de les introduire en rivière. Plusieurs hypothèses ont été émises afin de comprendre le faible taux de survie des individus ensemencés. L’une d’elle fait intervenir les interactions hôtes-microbiote, lesquelles diffèrent entre les individus nés en pisciculture et nés en milieu naturel. Cette hypothèse devient pertinente puisque le microbiote joue un rôle majeur sur la physiologie et le métabolisme des Vertébrés, ce dernier étant associé au développement du système immunitaire et digestif, en plus de contrôler la sécrétion de nombreuses hormones et d’être intimement lié à la régulation de plusieurs gènes. Or, il a récemment été démontré qu’avant l’ensemencement, les saumons élevés en pisciculture abritent dans leurs intestins des bactéries différentes de celles retrouvées chez les saumons sauvages au même stade de vie. En posant l’hypothèse selon laquelle la composition du microbiote des saumons ensemencés conserverait des différences après l’ensemencement, nous avons comparé des individus ensemencés et sauvages issus de la même population génétique. Plus précisément, les objectifs de ce projet sont d’étudier l’évolution du microbiote des poissons ensemencés, nés en pisciculture, en le comparant à celui de leurs confrères sauvages.

 

Suite à la récolte et la dissection des intestins de tacons sauvages et ensemencés, une librairie d’amplicons a été fabriquée et séquencée à l’aide des amorces 519-F et 745-R, visant la région V4 de la petite sous-unité ribosomale de l’ARN 16S. À l’aide d’outils bioinformatiques (DADA2, Phyloseq), il a été possible de déterminer le profil taxonomique (composition, diversité et structure) et fonctionnel des échantillons récoltés.

 

Les résultats montrent que les poissons ensemencés conservent un microbiote intestinal différent des poissons sauvages, même plusieurs mois après avoir été introduits en milieu naturel. Par ailleurs, le microbiote des saumons sauvages montre des caractéristiques distinctes de celui des ensemencés, notamment en termes de structure (diversité alpha), ainsi que de composition, avec une prédominance de bactéries du genre Pediococcus. En plus d’une différence significative en termes de composition taxonomique, l’inférence fonctionnel du profil bactérien montre des distinctions entre les deux groupes étudiés.

De tels résultats suggèrent que la physiologie pourrait également être affectée par ces différences, pouvant expliquer une partie du faible succès des méthodes d’ensemencement actuelles. Les résultats obtenus pourront d’ailleurs être pris en compte pour les méthodes de conservation actuelles. En effet, sachant que le microbiote est étroitement lié à la physiologie, il devient très pertinent d’envisager l’implémentation dans les pratiques de restauration des populations naturelles les notions d’écologie microbienne dans le but d’assurer une meilleure survie des individus ensemencés.

Étude de la diversité insoupçonnée de la bactérie Leptospira sp.


Antony Vincent1, Olivier Schiettekatte2, Pascale Bourhy2, Mathieu Picardeau2, Frederic veyrier1
1INRS-Institut Armand-Frappier 2Institut Pasteur

    La leptospirose est une maladie zoonotique d’envergure mondiale. L'une des principales voies de transmission de la leptospirose est l'environnement naturel contaminé par l'urine d'animaux. Les sols et les eaux de surface abritent également une grande diversité d’espèces de Leptospira pour lesquelles le statut de virulence n'est pas clairement établi. Le genre Leptospira est historiquement divisé en 35 espèces classées en trois groupes phylogénétiques, censés être en corrélation avec la virulence de la bactérie. Plusieurs génomes de cette bactérie sont actuellement disponibles, mais ceux-ci proviennent principalement de souches pathogènes d’Amérique latine et d’Asie. La diversité réelle de Leptospira était donc largement inconnue.

 

    Dans cette étude, l’ADN de 90 souches de Leptospira isolées de différents environnements de plusieurs régions dans le monde, dont le Japon, la Malaisie, la Nouvelle-Calédonie, l'Algérie, la France métropolitaine et l'île de Mayotte, a été séquencé. Grâce à une phylogénie moléculaire utilisant les séquences de 1371 gènes, nous avons été en mesure de redéfinir la taxonomie du genre Leptospira, incluant la découverte de 30 nouvelles espèces et d’une lignée sœur à celle traditionnellement considérée comme saprophyte. Cette analyse systématique a permis de démontrer la faiblesse du gène de l’ARNr 16S et de proposer le gène ppk comme alternative afin de classer avec robustesse les souches. Nous avons aussi pu mettre en lumière une dichotomie au sein des espèces considérées comme pathogènes et déterminer les caractéristiques génétiques propres à chacun des groupes. Finalement, nous avons trouvé que les souches pathogènes ont un pan-génome plus ouvert que les espèces des autres groupes. Cela suggère un remaniement des fonctions cellulaires chez les espèces de ce groupe par de multiples transferts horizontaux de gènes qui auraient pu permettre un changement de la niche écologique. Bien que la raison ne soit pas encore tout à fait claire, il est possible de penser que le grand nombre d'hôtes potentiels pouvant être infectés par ces espèces nécessite une certaine spécificité et que les transferts horizontaux peuvent être l'une des méthodes permettant une adaptation rapide à ces hôtes en fournissant un répertoire en gènes adapté à ceux-ci.

Études in vivo de la protéine TraC codée par le plasmide conjugatif pKM101 chez E. coli.


Jaafar Amro1, Christian Baron1
1Département de biochimie et médecine moléculaire, Université de Montréal.

La conjugaison bactérienne est un processus de transfert de matériel génétique entre les bactéries. Ces informations génétiques transférées sont souvent bénéfiques à la survie des bactéries dans leurs milieux hôtes, comme les gènes de résistance aux antibiotiques qui transforment les bactéries en « superbactéries » résistantes à tous les antibiotiques.

La conjugaison bactérienne se fait par l’intermédiaire d’un système de sécrétion appelé système de sécrétion de type IV (T4SS). Les T4SSs existent chez les bactéries Gram négatives et Gram positives. Chez Escherichia coli, notre model d’étude, le T4SS est composé de 12 protéines codées par le plasmide conjugatif pKM101, et groupées en trois parties : 1- le pilus sur la surface bactérienne qui permettrait le contact entre la bactérie et la cellule hôte, 2- le canal transmembranaire traversant les membranes interne et externe, et permettant le transfert des matériels génétiques vers la bactérie receveuse, et 3- trois ATPases amenant l’énergie pour effectuer le transfert.

Notre projet de recherche a pour but d’étudier la protéine TraC, l’homologue de VirB5 chez Agrobacterium tumefaciens (le modèle du T4SS le mieux étudié à ce jour), afin de bien comprendre son rôle durant la conjugaison, notamment dans le processus de reconnaissance et l’adhésion aux cellules cibles, surtout qu’elle est la seule protéine sécrétée parmi le complexe du T4SS et qu’elle est supposée de se localiser sur le bout de pilus (comme VirB5). Notre objectif est de visualiser à haute résolution la localisation de TraC dans la cellule et durant la conjugaison, et de mieux comprendre l’intérêt de la sécrétion de TraC dans le milieu extracellulaire. Nous allons utiliser la microscopie à fluorescence à haute réoslution et la microscopie électronique pour la localisation de TraC. Nos résultats préliminaires montrent une localisation de TraC sur la surface cellulaire et cela d'une façon indépendante de la présence du système de sécrétion type IV. Nous travaillons actuellement pour étudier la localisation de TraC durant la conjugaison.

Nous espérons que les résultats obtenus par ce projet seront utiles pour mieux comprendre l’étape de la reconnaissance et l’adhésion à la cellule receveuse durant la conjugaison, ce qui nous aidera dans la conception des molécules inhibitrices du T4SS. L’inhibition du système de transfert des gènes chez les bactéries peut être une cible importante pour limiter la propagation de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes, et de ce fait pouvoir diminuer la mortalité et la morbidité causées par ce type d’infection. En plus de leurs rôles dans le transfert des gènes de résistance, les T4SSs sont essentiels pour la virulence de nombreuses bactéries pathogènes tels que Agrobacterium tumefaciens (transfert de gènes et formation de tumeurs sur les plantes), Bartonella henselae (grippe de chat), Bordetella pertussis (coqueluche), Helicobacter pylori (gastrite et cancer de l'estomac) et Legionella pneumophila (la maladie du légionnaire).

Eukaryotic Community of Cooling Towers and its Relationship with the Pathogen Legionella pneumophila


Kiran Paranjape1, Émilie Bédard2, Michèle Prévost2, Sébastien Faucher1
1McGill University 2École Polytechnique de Montréal

Legionnaires’ Disease is a severe pneumonia caused mainly by the bacterium Legionella pneumophila. Cooling towers are the main sources of the bacteria during large outbreaks. The mechanisms leading to an outbreak are not well understood. Colonization, survival, and proliferation of the pathogen in cooling towers are important steps. These steps are influenced by several factors, such as the chemical parameters of the environment, the presence of biofilm, and the presence of host cells, such as amoeba and ciliates. However, it is not clear what species of host cells are present in cooling towers and what are the factors affecting their populations. Consequently, we characterized the eukaryotic community of 18 cooling towers using an 18S rRNA amplicon sequencing approach. The results indicated that cooling towers were quite diverse in their eukaryotic composition. Several taxa containing potential host species were presents in the towers. These host taxa were present at levels as high as 30% within certain cooling towers potentially indicating that these towers were at risk for outbreaks. More interestingly, two host taxa (Vermamoeba and Olygohymenophorea) were positively correlated with Legionella spp and alpha diversity. Further analysis revealed that several bacterial groups were important factors for the presence of these host taxa, such as Sphingomonas and Brevundimonas. This suggests that the establishment of a host cell population depends on the presence of certain groups of bacteria in the cooling tower environment.

Experimental evolution of Legionella pneumophila under heat stress


Jeffrey Liang1, Sebastien Faucher1
1McGill University

Legionella pneumophila is a bacterial pathogen able to colonize hot water infrastructure, which allows it to aerosolize and cause Legionnaires’ Disease - a severe respiratory infection. Pasteurization of these water systems is a common form of pathogen control, but population levels often rebound after treatment. The incomplete sterility caused by pasteurization exerts a selective pressure on the contaminating L. pneumophila population, raising the ability of the pathogen to tolerate more intense regimens of heat treatment. This phenomenon shows the capacity of L. pneumophila to adapt to heat stress in situ. To better understand this process, we have established a laboratory model to recapitulate the evolutionary dynamics of L. pneumophila when challenged with repeated pasteurization cycles. From replicate lines of the original Philadelphia-1 outbreak strain, an experimental evolution model of L. pneumophila has been developed through cycles of population depletion during heat-shock and recovery in broth medium. This system has resulted in all six evolved lineages acquiring the ability to withstand both longer and higher-temperature heat shock than their common ancestral strain - evidence of a repeatable phenotypic change. Future work with this model aims to investigate convergent and divergent mutations across the replicate lineages to illuminate the mechanisms behind the heat resistance of L. pneumophila and the evolutionary dynamics that drive its increased ability to withstand heat shock.

Expression et régulation du fimbria curli chez Salmonella enterica sérovar Typhi


Valérie Labelle1, France Daigle1
1U de Montréal

Certaines bactéries de la même espèce peuvent posséder une grande diversité de spectre d’hôte et de virulence. Chez Salmonella, le sérovar Typhi infecte seulement l'Homme et cause la fièvre typhoïde, alors que le sérovar Typhimurium infecte plusieurs espèces animales et cause une gastroentérite chez l'Homme. Une distinction majeure entre ces deux sérovars est l’expression du fimbria curli (csg), composé de fibres amyloïdes présent à la surface bactérienne. Ils sont associés avec l'adhésion, l'invasion et la persistance. Curli est exprimé dans des conditions particulières. Chez S. Typhimurium, la meilleure condition d’expression de curli est à 30°C en milieu tryptone, mais chez S. Typhi, elle n’est pas connue. De plus, à 30°C sur gélose avec rouge de Congo, les colonies de S. Typhi sont blanches et lisses, suggérant qu’il n'y a pas de production de curli, alors que les colonies de S. Typhimurium sont rouges et rugueuses, suggérant qu’il y a production de curli. Cependant, le ou les gènes expliquant cette différence au niveau de l'expression de curli ne sont pas connus. Notre hypothèse est que l’expression de curli est régulée différemment entre S. Typhi et S. Typhimurium, ce qui donne le phénotype différent observé sur rouge de Congo. Notre but est d’identifier le milieu optimal à l’expression de curli chez S. Typhi et les protéines impliquées dans la régulation de curli.

 

L'expression de curli a été déterminée dans différentes conditions de croissance par des essais de bêta-galactosidase où le promoteur csgB est fusionné avec le gène rapporteur lacZ. Chez S. Typhi et S. Typhimurium, curli est plus exprimé en tryptone qu’en LB, probablement dû à l’absence de sel dans le premier milieu. Curli est plus exprimé à 37°C chez S. Typhi et à 30°C chez S. Typhimurium.

 

Le régulateur principal de curli chez S. Typhimurium est csgD. Lorsqu’il est muté, l’expression de curli diminue significativement. Cependant, chez S. Typhi, une mutation de csgD ne montre aucun changement dans l’expression de curli. Une analyse de séquence a montré que csgD de S. Typhi possède une mutation au nucléotide 627 qui crée un codon stop prématuré. Ainsi, il est possible que le csgD muté ne puisse plus se lier au promoteur csgB afin d’augmenter son niveau d’expression. Le gène csgD de S. Typhimurium a été cloné sur un plasmide de faibles copies afin de l’insérer chez le mutant csgD de S. Typhi. Nous avons aussi fait l’inverse, soit insérer le plasmide avec le csgD de S. Typhi dans S. Typhimurium. L’expression de curli a été évaluée par le phénotype des bactéries sur géloses avec rouge de Congo. S. Typhimurium avec le csgD de S. Typhi devient blanc sur gélose avec rouge de Congo à 30°C. S. Typhi avec le csgD de S. Typhimurium devient rouge à 30 et 37 °C, mais pas aussi rouge que la souche sauvage de S. Typhimurim à 30°C. Ainsi, il doit y avoir une autre différence entre S. Typhi et S. Typhimurium que csgD afin d’expliquer le faible niveau de curli chez S. Typhi.

 

Cette différence est probablement au niveau d’autres régulateurs. Ainsi, l’expression de curli a été déterminée chez différents mutants en milieu LB à 37°C. Dans certains cas, le niveau d’expression augmentait, alors que d’en d’autres il diminuait ou restait stable. Ceci va permettre de poursuivre nos recherches afin de déterminer s’il y a un activateur du promoteur csgB présent chez S. Typhi, mais absent chez S. Typhimurium ou s’il y a un inhibiteur du promoteur csgB absent chez S. Typhi, mais présent chez S. Typhimurium.

 

Pour conclure, chez S. Typhi, curli est plus exprimé à 37°C en tryptone, mais son expression est faible. Ceci est principalement causé par csgD, mais d’autres gènes sont probablement impliqués. La différence d’expression de curli entre S. Typhi et S. Typhimurium peut expliquer la distinction de la spécificité d’hôte de ces deux bactéries. L’étude des conditions et des régulateurs de curli ouvrira la voie pour déterminer les mécanismes de régulation spécifiques à chacun des sérovars. Nos résultats pourront éventuellement servir pour le développement de stratégies antimicrobiennes.

Habiter une oasis acide dans un désert d’ions : le secret des communautés bactériennes des poissons Amazoniens


François-Étienne Sylvain1, Aleicia Holland2, Émie Audet-Gilbert1, Adalberto Luis Val3, Nicolas Derome1
1Institut de biologie intégrative et des systèmes, Université Laval, Québec, Canada 2La Trobe University, Victoria, Australia 3Instituto Nacional de Pesquisas da Amazonia, Manaus, AM, Brésil

L’Amazone brésilien contient la communauté de poissons d'eau douce la plus diversifiée au monde. Celle-ci prospère dans un gradient d’environnements contrastés, allant des eaux noires acides (pH jusqu’à 2.8) et pauvres en ions, aux eaux blanches neutres et riches en ions. Ce gradient hydrochimique structure les assemblages de poissons amazoniens puisqu’il est à l’origine d’événements de spéciation écologique. Les communautés microbiennes des poissons contiennent une partie fondamentale du patrimoine génétique de leurs hôtes et sont également impliquées dans la divergence adaptative en facilitant certains processus d’adaptation de niche. Cependant, on ignore dans quelle mesure les communautés microbiennes des poissons évoluent en fonction du gradient hydrochimique en Amazonie. Dans le cadre de notre étude, nous avons caractérisé les communautés microbiennes (mucus intestinal et cutané) de deux espèces d’hôtes divergentes (le cichlidé drapeau, Mesonauta festivus et le piranha nopir, Serrasalmus rhombeus) réparties dans ce gradient hydrochimique. L'objectif principal de l’étude était de caractériser les variations intra et interspécifiques du microbiome des poissons amazoniens à plusieurs échelles. En utilisant une approche de métabarcodage 16S, nous avons étudié le microbiote de 43 échantillons de M. festivus sauvages, de 32 échantillons de S. rhombeus et de sept échantillons d'eau, prélevés sur sept sites d'échantillonnage le long du gradient hydrochimique. Nous avons observé une réponse significative des communautés microbiennes (au niveau de la composition et la diversité) des deux espèces hôtes au gradient hydrochimique, comprenant un continuum de valeurs de magnésium, de sodium, de carbone organique dissous, de calcium, d'O2 dissous, de pH, de potassium, de dureté, de chlorure et de température. Nous avons mis en évidence l’existence de structures parallèles et conservées entre poissons hôtes d’une même espèce à différents sites d’une même couleur d’eau (parallélisme intraspécifique). Nous montrons aussi l’existence d’un parallélisme interspécifique dans la réponse des deux espèces au gradient hydrochimique. Ensemble, ces parallélismes suggèrent la sélection positive de certains éléments structuraux de la communauté microbienne le long du gradient hydrochimique amazonien. Prochainement, des approches fonctionnelles associées à des expériences de transplantation réciproques fourniront des informations supplémentaires sur la contribution potentielle des microbiomes des poissons amazoniens aux processus d’adaptation des hôtes et de spéciation écologique.

Identification de nouveaux mécanismes de régulation génique de la voie Gac/Rsm chez Pseudomonas aeruginosa


Charles Morin1, Eric Déziel1
1INRS-Institut Armand-Frappier

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste principalement reconnue pour sa résistance innée aux traitements antibiotiques et les infections qu’il cause chez l’humain. Les raisons de cette résistance sont multifactorielles: P. aeruginosa possède un génome relativement large pour une bactérie, codant pour de multiples mécanismes de résistance aux agents antimicrobiens et de système de régulation lui permettant de s’adapter plus aisément à son environnement. L’un des systèmes de régulation impliqué dans l’adaptation de P. aeruginosa est la voie Gac/Rsm. Brièvement, le système à deux composantes GacS/GacA active transcription de deux petits ARN (pARN) RsmY et RsmZ. Ces derniers peuvent lier et séquestrer le régulateur posttranscriptionnel global RsmA. La disponibilité de RsmA agira pour moduler l’alternance entre le mode de vie sessile (biofilm), liée aux infections chroniques et le mode de vie motile, lié aux infections aigues. Nous avons récemment révélé l’existence d’une voie non identifiée impliquée dans la surexpression RsmZ lorsque P. aeruginosa croît sur une surface, comparativement à des conditions planctoniques. Grâce à un criblage par mutagénèse aléatoire, nous avons mis en lumière plusieurs facteurs avec un effet positif sur l’expression de RsmZ, dont la glycosyltransférase FgtA, le régulateur IHF, le système de quorum sensing médié par le Pseudomonas Quinolone Signal (PQS) ainsi que d’autres protéines impliquées dans le métabolisme. Une meilleure connaissance des systèmes d’adaptation à une surface et de transition vers un mode de vie sessile est crucial pour mieux comprendre la pathogénèse de P. aeruginosa.

Identification des protéines TAM-dépendantes chez Pseudomonas aeruginosa


Hamid Zeneba1, Jihen Ati1, Marie-Christine Groleau1, Eric Déziel1, Charles Calmettes1
1INRS-Université du Québec

La membrane externe participe à de nombreuses fonctions importantes aux cellules bactériennes et joue un rôle majeur dans les interactions hôte-pathogène. En particulier, les protéines de la membrane externe sont impliquées dans de nombreuses fonctions, telles que l’adhésion, le transport des nutriments et des macromolécules, la communication, la pathogenèse bactérienne, et la division cellulaire. La plupart des protéines de la membrane externe chez les bactéries à Gram-négatif sont synthétisées dans le cytoplasme, puis transférées vers le périplasme via la membrane interne avant d’être redirigées vers la membrane externe où elles sont reconnues, assemblées et insérées dans la bicouche lipidique. L’assemblage et l’insertion de ces protéines nécessitent la machinerie d’assemblage des tonneaux bêta (système BAM). Cependant, un second complexe d’assemblage des protéines transmembranaires appelé module de translocation et d’assemblage (système TAM) a été récemment identifié chez de nombreuses protéobactéries. Il est composé de deux sous-unités TamA et TamB formant un complexe trans-enveloppe. TamA est une protéine de la famille des Omp85 ancrée dans la membrane externe, et est homologue à la protéine BamA. TamB est ancrée à la membrane interne par une hélice N-terminale transmembranaire, et ne possède pas d’homologue connu. L’association de TamA et TamB permet le repliement et l’assemblage spécifique de certaines protéines de la membrane externe, cependant la gamme de protéines TAM-dépendantes demeure inconnue. La délétion du complexe TAM chez les bactéries Salmonella enterica, Klebsiella pneumonia, Proteus mirabilis et Vibrio fischeri entraîne un défaut de colonisation et une perte de virulence, suggérant que le complexe TAM est un élément important dans la virulence de plusieurs bactéries à Gram négatif pathogènes. Nos travaux préliminaires réalisés chez Pseudomonas aeruginosa, un important pathogène opportuniste impliqué dans des infections nosocomiales, montre qu’une mutation par insertion de transposons inactivant les gènes tamA ou tamB entraîne un défaut de formation de biofilm, un trait de virulence majeur de cette bactérie. Le but de ce projet est d’identifier les protéines sécrétées et insérées dans la membrane externe par le module TAM, et de définir leurs fonctions moléculaires. Les protéines requérant TAM pour leur assemblage pourraient être d’importants facteurs de virulence et de ce fait constituer des cibles potentielles pour de nouveaux traitements antimicrobiens contre les infections à P. aeruginosa.

Identification of a new series of quinazoline derivatives targeting the cytochrome bc1 in Mycobacterium tuberculosis


Andréanne Lupien2,4, Caroline Foo-Shi Yan2, Anthony Vocat2, Jeremie Piton2, Vadim Makarov1, Stewart T. Cole2,3
1FRC Fundamentals of Biotechnology RAS, Moscow, Russian Federation 2Global Health Institute, Federal Institute of Technology in Lausanne, Lausanne, Switzerland. 3Institut Pasteur de Paris, Paris, France. 4McGill University Health Centre

The emergence of multi-drug (MDR-TB) and extensively-drug resistant tuberculosis (XDR-TB) is a major threat to the global management of TB worldwide. In the last twenty years, only two new antimycobacterial drugs, bedaquiline and delamanid, were approved for the treatment of MDR-TB. New chemical entities are indeed of need to treat drug-resistant TB. In this study, the mode of action of a new potent series of quinazoline derivatives was investigated against Mycobacterium tuberculosis (M. tb). Four derivatives (11626141, 11626142, 11626252 and 11726148) showed good activity (MIC ranging from 0.02-0.09 ug/mL) and low toxicity (TD50 ≥ 5ug/mL) against M. tb H37Rv and HepG2 cells, respectively. 11626252 was the most selective compounds tested from this series. Quinazoline derivatives were found to target the cytochrome bc1 terminal oxidase with a different mode of interaction compared to those of known QcrB inhibitors. Further analysis of the mechanism of action of the drug revealed that 11626252 exposure leads to ATP depletion and overexpression of the cytochrome bd oxidase, the second terminal oxidase of the electron transport chain in M.tb. In the absence of cytochrome bd oxidase, the quinazoline derivatives are bactericidal, an encouraging property for future antimycobacterial drug development. Our study suggests that the quinazoline-derived compounds are an attractive chemical entity for M. tb drug development.

 

 

Identification of two aptamers binding to Legionella pneumophila


Mariam Saad1, Deanna Chinerman2, Maryam Tabrizian3, Sebastien Faucher4
1McGill University 2Université McGill 3McGill University 4McGill University

Identification of two aptamers binding to Legionella pneumophila

Legionellae are water-borne pathogens whose widespread prevalence is intensified by mismanagement of engineered water systems. Upon aerosolization, Legionella pneumophila (Lp) can infect human lungs and cause a severe pneumonia called Legionnaires’ disease. Several large outbreaks were recently reported. Rapid and effective detection strategies are urgently needed to improve management strategies and prevent the spread of the bacteria. Aptamer-based biosensors can provide rapid and economical detection platforms. Aptamers are short, single stranded DNA or RNA oligonucleotides that can bind to a wide variety of targets ranging from small compounds to whole cells with high affinity and specificity. We created specific aptamers for detecting Lp in complex environmental matrices by using Cell-SELEX. Cell-SELEX is an iterative process which involves incubating Lp cells with a random pool of oligonucleotides, separating the cell bound and unbound oligonucleotides and amplifying the cell bound sequences via PCR for the next round of selection. After observing a decrease in sequence diversity of the nucleotide pool with increasing SELEX rounds, we cloned and sequenced our aptamer pools. We identified two aptamers: R10C5 and R10C1. Their affinity and specificity were characterized via flow cytometry and fluorescence microscopy. Their dissociation constants KD are115nM for R10C5 and 135nM for R10C1. In addition, we show that the aptamers bind preferentially to Lp cells as opposed to other bacteria such as Pseudomonas. We conclude that our aptamers have affinity to and are selective for Lp. They can therefore serve as viable biorecognition elements in multiple detection assays

Implication des gènes codant pour curli dans l'auto-agglutination et la formation de biofilm dans la souche d'E. coli enterohémorragique Sakai


Yaindrys Rodriguez Olivera1, Philippe Vogeleer1, Frédérique White2, Antony Vincent3, Steve Charette4, Josee Harel1
1Faculté de médecine vétérinaire, Université de Montréal 2Université de Sherbrooke 3INRS-Institut Armand-Frappier 4Institut de biologie intégrative et des systèmes, Université de Laval

Les souches d'Escherichia coli produisant de Shiga-toxines (STEC), dont E. coli entérohémorragique (EHEC) O157: H7, sont des agents pathogènes de santé publique qui causent des toxi-infections collectives sévères d'origine alimentaire. Chez les humains, elles peuvent provoquer des affections modérées, comme la diarrhée, à graves, accompagnées de complications parfois mortelles. EHEC ont la capacité à former des biofilms. Ceci favorise leur persistance dans l'environnement et qui rend difficile le contrôle de la contamination dans les usines de production et de transformation des aliments.

Certaines souches EHEC dont la souche Sakai possèdent  une capacité accrue d'auto-agglutination et de formation de biofilm. Il est donc important de comprendre le mécanisme de ce phénomène afin de développer des méthodes préventives ciblées. Le but de l’étude vise à identifier les gènes impliqués dans l'auto-agglutination et la formation de biofilms dans la souche de référence Sakai.

Pour cela, une banque de mutants par transposition a été générée chez Sakai. D’un pool de 22 mutants présentant une capacité réduite à agglutiner et former un biofilm, les sites d’insertion ont été identifiés par séquençage à haut-débit. Parmi les gènes ciblés, csgB et csgG, impliqués dans la formation de curli, étaient fortement représentés. Les mutants individuels de ces gènes ont été identifiés par PCR, évalués pour leur formation de biofilm et leur capacité d'autoagglutination. Par la suite ces mutants ont été  caractérisés pour des phénotypes associés aux capacités des souches à produire des biofilms, tels que le morphotype de colonies, la production de cellulose et la motilité, ainsi que pour leur capacité à agglutiner la levure de façon mannose-indépendante. La complémentation a été réalisée en utilisant le plasmide d'expression pTrc99a. De même, l'expression relative des gènes des opérons curli a été évaluée par qRT-PCR dans un biofilm de Sakai sur 24 heures, comparativement à celle de la souche de référence EDL933, non-autoagglutinante et productrice de biofilm plus faible.

La souche Sakai a présenté un morphotype RDAR (rouge, sec et rugueux) producteur de curli, tandis que les mutants csgB et csgG, et EDL933 étaient SAW (lisse et blanc), typiques des souches non-curli. La motilité de Sakai et les mutants était inférieure à celle d’EDL933. En outre, les mutants ont perdu la capacité d'agglutination à la levure mannose-indépendante. La complémentation du mutant csgG a restauré le phénotype caractéristique de la souche sauvage Sakai. L'étude comparative de l'expression des gènes csg par qRT-PCR a révélé que csgA, csgD et csgG étaient significativement surexprimés chez Sakai, productrice des biofilms forts, par rapport à EDL933 productrice de biofilms plus faibles.

Le projet permet de mieux cerner le mécanisme de formation de biofilm dans EHEC et d'identifier de biomarqueurs. Ceci permettrait de définir de futures cibles pour contrer la formation de biofilms, afin de  prévenir la persistance de ces bactéries dans des différents environnements incluant l’industrie agro-alimentaire.

Inhibition of Cagα, a T4SS ATPase required for Helicobacter pylori virulence


Tarun ARYA1, Flore OUDOUHOU1, Bastien CASU1, Benoit BESSETTE1, Claire Morin1, Jurgen SYGUSCH1, Christian BARON1
1Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal, Montréal, Canada

Helicobacter pylori is a bacterium that colonizes half of the human population. It carries a pathogenicity island cag (cytotoxin-associated gene pathogenicity island : cagPAI) encoding 27-31 Cag proteins that assemble into a syringe-like apparatus, the T4SS (type 4 secretion system), consisting of a membrane-spanning secretion channel and an extracellular pilus. The T4SS allows the injection of CagA (cytotoxin-associated gene A), an oncoprotein, directly into gastric cells. CagA interacts with a large number of host cell proteins. This results in cytoskeleton rearrangements and in deregulation of several signal transduction pathways, highly increasing the risk of developing gastric disease like ulcer and gastric cancer. Stomach cancer is the sixth most common cancer (1.03 million cases) and the third most deadly one (WHO 2018). To reduce cancer risk, the eradication of pathogenic H. pylori with antibiotic treatment is indicated. However, H. pylori can easily be transformed and acquires antibiotic resistance. In 2017 the WHO published a report explaining the urgency of finding new antibiotics for several bacteria including H. pylori.

We study potential anti-virulence molecules that targeted specific proteins in the bacteria, such as inhibitors of the T4SS ATPase Caga. A fragment library was screened by differential scanning fluorimetry (DSF), and 16 stabilizing fragments were identified. A malachite green ATPase test and crosslinking assays were performed to assess the effects of these 16 fragments on Caga. Four of the sixteen fragments inhibited the ATPase activity and molecule 1G2 had the lowest inhibition constant. X-ray crystallography showed that 1G2 does not interact with Caga at the ATP binding site and it appears to disrupt the hexamer form of the protein. 1G2 and some of its derivates are not toxic for H. pylori and the molecules reduced IL-8 formation in AGS cells.

1G2 was also tested on H. pylori clinicals strains. 1G2 decreased the induction of IL-8 in most of the strains and one of them is resistant.

Our results show the efficiency of fragment-based screening to identified new chemical entities that bind Cagα and will enable the design of more potent small molecules to inhibit H. pylori virulence.

Integrin-like tethering of motility complexes at bacterial focal adhesions


Salim Timo Islam1, Akeisha Belgrave2, Nicolas JOLIVET1, Laetitia MY3, Gaurav Sharma4, Mitchell Singer4, Joshua Shaevitz2, Tâm Mignot3
1INRS—Institut Armand-Frappier 2Princeton University 3CNRS - Laboratoire de chimie bactérienne 4University of California, Davis

Directed surface motility of metazoan cells and protozoan parasites involves substratum engagement by surface-exposed integrin(-like) adhesins, directionally transported by molecular motors via coupling to the internal cytoskeleton.  The predatory deltaproteobacterium Myxococcus xanthus uses a helically-trafficked motor at bacterial focal adhesions to power gliding motility.  However, the mechanisms of gliding machinery–substratum coupling and force mechanotransduction between inner-membrane motors and substratum are unknown.  Herein, we use bead force spectroscopy and TIRF microscopy to characterize CglB as the essential substratum-coupling integrin αI-domain-like adhesin.  Protease susceptibility reveals that CglB interacts with a globular-protein-accessorized β-barrel OM display platform, which regulates the cell-surface conformational state and accessibility of the adhesin.  Surface retention of CglB is further regulated by a cell-surface metalloprotease, a phenomenon also modulated by the OM display platform.  These data depict a complex mechanism for bacterial gliding adhesin secretion, cell-surface anchoring, and processing, with conserved themes between prokaryotic and eukaryotic cell motility.

Je suis ce qu’ils mangent : les interactions hôte-microbiote et leur importance dans la santé métabolique et immunitaire des salmonidés d’élevage


Jeff Gauthier1, Camille Lavoie1, Steve Charette1,2, Nicolas Derome1
1Institut de biologie intégrative et des systèmes (IBIS), Université Laval, Québec, Canada 2Centre de recherche de l’IUCPQ, Hôpital Laval, Québec, Canada

Les Salmonidae (truites et saumons) constituent le deuxième groupe de poissons d’élevage au monde, avec une production annuelle totalisant deux millions de tonnes.  Pour pallier la forte demande en protéines animales d’une population humaine en croissance exponentielle, les aquaculteurs ont recours à des pratiques intensives d’élevage. En contrepartie, les poissons sont exposés à différents facteurs de stress (manipulation, transport, surstockage et eau polluée) interférant avec le maintien de leur homéostasie. Les aquaculteurs ont donc recours à l’utilisation de méthodes sanitaires, prophylactiques et curatives à large spectre pour compenser l’affaiblissement du système immunitaire causé par une réponse au stress sursolicitée.  Ces méthodes ont cependant l’incovénient de perturber l’interaction entre les poissons et leur flore microbienne (c.-à-d. le microbiote).

 

En effet, tous les Métazoaires vivent en association étroite avec plusieurs milliers de milliards de cellules bactériennes. Leur abondance est telle qu’elles sont jusqu’à deux fois plus nombreuses que les cellules de leur hôte. Jusqu’à 1.5 % de la biomasse d’un individu peut provenir de ces microorganismes, lesquels aident à la métabolisation de nutriments indigestibles uniquement que par leur hôte, ou encore, aident à prévenir la colonisation des tissus épithéliaux par des agents pathogènes.

 

L’importance des salmonidés dans l’alimentation mondiale justifie une meilleure compréhension de leurs interactions hôte-microbiote. Cette présentation fait état des connaissances actuelles sur les facteurs agissant sur le microbiote des salmonidés, ainsi que sur les manques à gagner en cette matière.

L'enrobage de quatre bactéries différentes par deux protozoaires de type cilié du genre Tetrahymena


Alicia Durocher1,2, Alix Denoncourt1,2, Valérie Paquet1,2, Steve Charette1,2,3
1Institut de biologie intégrative et des systèmes (IBIS) 2Centre de recherche de l'Institut universitaire en cardiologie et pneumologie de Québec (CRIUCPQ) 3Département de biochimie, microbiologie et bio-informatique, Université Laval

Les protozoaires sont ubiquitaires dans la nature et plusieurs d’entre eux se nourrissent de bactéries. Certaines bactéries sont capables de résister à la phagocytose par les protozoaires, et se retrouvent parfois enrobées dans des corps multilamellaires (CML), qui les protègent de plusieurs conditions nocives. Ce phénomène a souvent été observé chez les bactéries pathogènes, dont des agents pathogènes respiratoires, et est suspecté de contribuer à la propagation de certaines d'entre elles. Cependant, beaucoup d’aspects concernant l’enrobage de bactéries doivent encore être compris.
Différentes bactéries résistant à la phagocytose par les protozoaires, et ayant des caractéristiques différentes (forme, paroi, hydrophobicité) seront utilisées à titre de modèle pour étudier leur potentiel enrobage par des protozoaires ciliés, entre autres, ceux du genre Tetrahymena, soit T. pyriformis et T. thermophila.
Ces organismes seront mis en co-culture ensemble puis incubés à différentes températures. Des colorants fluorescents comme le DAPI et le LIVE/DEAD permettront de visualiser à l’aide de la microscopie à épifluorescence la morphologie des CML et la viabilité des bactéries enrobées. Des échantillons seront ensuite observés en microscopie électronique afin de mieux caractériser l’enrobage et la viabilité.
Les quatre bactéries présentaient des morphologies de CML distinctives et caractéristiques de chaque souche, mais aucun lien direct ne put être établi entre la paroi, la forme ou l’hydrophobicité de la bactérie et l'enrobage.
Ces travaux visent à identifier les caractéristiques influençant l’enrobage de bactéries, tant le processus d’enrobage que la morphologie du CML, et à développer un protocole de purification de CML. D'autres expériences seront nécessaires pour identifier les facteurs contrôlant ce phénomène.

La motilité sociale de type swarming, une pression sélective pour des mutants du quorum sensing chez le pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa


Sophie Robitaille1, Eric Déziel1
1INRS-Institut Armand-Frappier

Les bactéries sont capables de se déplacer dans divers environnements par plusieurs moyens de locomotion, telle que la motilité de type swarming. Ce type de motilité permet à un groupe de bactéries de se déplacer par un mouvement coordonné sur une surface semi-solide. Pour ce faire, la bactérie a besoin d’un flagelle fonctionnel favorisant la locomotion et la production d’un agent mouillant pour contrecarrer la tension de surface. La production de cet agent est sous la régulation du quorum sensing (QS), soit le mode de communication des bactéries. Le modèle bactérien Pseudomonas aeruginosa a été utilisé pour mieux comprendre la motilité de type swarming.  Nous étudions dans notre laboratoire le mutant hptB-, qui permet le contrôle entre la vie sur surface et la vie en bouillon. Ce mutant produit des rhamnolipides, l’agent mouillant de P. aeruginosa, et exprime un flagelle fonctionnel; soit les deux éléments essentiels à la condition swarming. Toutefois, il a un défaut de motilité de swarming. Pour identifier l’élément manquant qui explique ce défaut, une évolution dirigée a été réalisée en condition swarming afin de récupérer la motilité de ce mutant. Après quelques passages, des mutants ayant récupéré la capacité de faire du swarming émergent. Le séquençage du génome a été réalisé sur plusieurs clones ayant évolué et des mutations spontanées ont été retrouvées dans le gène lasR, qui code pour un régulateur du QS. Ces mutants qui ne semblent pas responsables pour compenser le défaut de motilité swarming se retrouvent abondants dans la population. Ces résultats laissent croire que les mutants QS sont avantagés en motilité de type swarming. Pensant que l’apparition de telles mutations était spécifique au mutant hptB, une évolution dirigée sur la souche sauvage a été réalisée pour confirmer. Étonnamment, des mutants de QS sont aussi apparus dans l’évolution de la souche sauvage. Ces résultats appuient l’hypothèse que la condition de swarming sélectionne pour des mutants de QS. Afin d’expliquer l’avantage adaptatif de tels mutants, plusieurs hypothèses sont présentement considérées, incluant un possible bénéfice nutritionnel.

La polymyxine B en concentration sous-inhibitrice chez Vibrio choerae induit une inhibition de la formation de biofilm lié à une aflagellation des cellules


Sean Giacomucci1, Candice Cros1, Xavier Perron1,2, Marylise Duperthuy1
1University of Montreal 2INRS-Institut Armand-Frappier

Dans le règne bactérien la formation de biofilm est un mécanisme quasiment universel permettant aux bactéries de survire et de persister dans l’environnement. La formation de biofilm est chez Vibrio cholerae, la bactérie à Gram négatif responsable du choléra, une étape importante dans sa pathogenèse, sa virulence et sa dissémination. La formation de biofilm chez V. cholerae débute par l’attachement de la bactérie à une surface, s’ensuit la synthèse des différents composants formant la matrice du biofilm mature. Chez V. cholerae la présence de flagelle est essentielle à l’étape initiale de formation du biofilm, le flagelle est nécessaire à la bactérie pour se déplacer et détecter la présence d’une surface afin de s'y attacher de manière irréversible. Dans cette étude nous analysons l’impact de la polymyxine B (PmB) en concentration sous-inhibitrice sur deux souches pathogènes de V. cholerae, A1552 et MO10, respectivement de sérotype O1 et O139. La PmB est un peptide antimicrobien cationique connu pour déstabiliser la membrane des bactéries à Gram négatif via son interaction avec le lipide A des lipopolysaccharides. Nous avons découvert qu’à concentration sous-inhibitrice la PmB avait pour effet de réduire significativement la formation de biofilm sur les deux souches de V. cholerae. Étant donné l’importance du flagelle dans la formation de biofilm, nous avons comparé la quantité de flagelline associées aux bactéries selon qu’elles aient ou non été traitées à la PmB par immunobuvardage. Nos résultats ont mis en évidence une diminution de la quantité de flagelline dans des extraits bactériens totaux, suggérant une diminution globale de la synthèse des flagelles. La réduction du nombre de bactéries flagellées a été confirmée par des observations en microscopie électronique. Des analyses de PCR quantitative sont en cours afin de vérifier si la PmB a un effet sur l’expression de gènes codants pour les éléments du flagelle. Nous observons également une diminution significative de la mobilité de V. cholerae en présence de PmB. Par ailleurs, des expérimentations d'immunobuvardage réalisés sur les surnageants de culture de V. cholerae ont permis de mettre en évidence une augmentation de flagelline libre dans le milieu de culture en présence de PmB. Ce résultat suggère que soit la flagelline est sécrétée librement, reflétant un défaut de polymérisation du flagelle, soit parmi la faible proportion de bactéries produisant un flagelle certains se détachent de la cellule. Étant donné que nous n'observons pas de dommage membranaire en cytométrie en flux en présence des concentrations sous-inhibitrices de PmB, une sécrétion libre de la flagelline est privilégiée.  Puisque le flagelle est important pour l'étape initiale de formation de biofilm, nous avons évalué l'effet de la PmB sur des biofilms préformés de V. cholerae. Nos résultats démontrent que la PmB n'a plus d'effet sur les biofilms préformés, suggérant que l’effet observé en biofilm est dû à la diminution du nombre de cellules flagellées. 

Le complexe TAM et son rôle dans la biogenèse des protéines membranaires chez les bactéries Gram-négatif


Jihen Ati1, Zeneba Hamid1, Charles Calmettes1
1INRS Institut Armand Frappier

La membrane externe (ME) est l’une des caractéristiques les plus distinctives et importantes des bactéries Gram-négatives. Elle est extrêmement riche en protéines de type tonneaux β, ainsi que des protéines à ancre lipidique. Ces dernières sont impliquées dans plusieurs mécanismes biologiques tels que la protection contre l’entrée de molécules toxiques, le transport de nutriments et de protéines, la communication cellulaire, ainsi que la survie et la pathogénicité des bactéries. De ce fait, l’assemblage et l’insertion des protéines membranaires intégrales est considéré comme un processus fondamental et hautement important. Cependant, très peu est connu sur ce phénomène. Ce processus requiert le fonctionnement d’une machinerie d’assemblage des tonneaux-β (BAM) qui assure le bon repliement et l’insertion de la majorité des protéines provenant du cytoplasme en passant par la membrane interne. Cependant un sous-ensemble mineur de protéines requiert un facteur supplémentaire identifié comme module de translocation et d'assemblage (TAM). Dans cette étude, nous nous intéressons au complexe TAM qui comprend deux protéines, TamA et TamB. Ce module forme un complexe trans-enveloppe et est conservé chez le protéobactéries. Des études antérieures basées sur la suppression des gènes TamA et TamB ont démontré la réduction de la virulence de différents agents pathogènes bactériens. De ce fait, ce système est considéré comme une cible anti-infectieuse prometteuse. Afin d’élucider le mécanisme fonctionnel du complexe TAM, certains objectifs ont été fixés. Dans un premier temps, nous chercherons à mettre en évidence le lien direct que joue TamA, dont la structure est connue, dans l’assemblage et l’insertion des protéines au sein de la bicouche asymétrique de la membrane externe. Pour cela, des membranes artificielles sous forme de liposomes seront assemblées et l’insertion de deux protéines membranaires dénaturés, OMP-A et OMP-X sera évaluée en présence et absence de la protéine TamA. Cette même méthodologie a permis de mettre en évidence la fonction de son homologue BamA, qui dans notre étude sera considéré comme témoin positif. Dans un deuxième temps, nous nous intéresserons à la protéine TamB, dont la structure et la fonction restent méconnus. Résoudre la structure de cette protéine est considéré comme un grand défi due à sa taille gigantesque de 140 kDa. Afin de réaliser ces études structurales, les différents domaines de TamB seront clonés et exprimés séparément, suivi de multiples essais de cristallisations. En troisième temps, nous nous intéresserons à la structure de l’hetero-complexe TamA/TamB afin d’élucider la régulation et le mécanisme d’interaction de ce complexe. Ce projet ouvrira la voie à une meilleure compréhension du mécanisme d’assemblage des protéines de la membrane externe chez les bactéries pathogènes, et offrira de nouvelles perspectives pour trouver des cibles thérapeutiques innovantes.

Les 4-hydroxy-3-méthyl-2-alkylquinolines pourraient-elles être impliqués dans la communication cellulaire et la virulence chez le complexe Burkholderia cepacia ?


Pauline Coulon1, Eric Déziel1
1INRS-Institut Armand-Frappier

Certaines espèces appartenant au genre Burkholderia – incluant Burkholderia pseudomallei, Burkholderia thailandensis, Burkholderia ambifaria et Burkholderia cepacia– produisent des 4-hydroxy-3-méthyl-2-alkylquinolines (HMAQ). Ces molécules sont des analogues d’une famille de molécules à laquelle appartient le Pseudomonas quinolone signal (PQS), impliqué dans la communication intercellulaire chez Pseudomonas aeruginosa. Le système Hmq est constitué de l’opéron hmqABCDEFG, codant pour les enzymes qui sont impliquées dans la synthèse des HMAQ à partir de l’acide anthranilique. 

Le complexe Burkholderia cepacia (Bcc) est un ensemble d’espèces similaires. Ces pathogènes opportunistes provoquent des infections hautement résistantes aux antibiotiques chez les patients atteints de la granulomatose chronique et ceux de la fibrose kystique, c'est pourquoi l’étude la prévalence des souches capables de produire des HMAQ ainsi que leur implication potentielle dans la virulence semblent être importants.

La distribution de l’opéron hmqABCDEFG au sein des Bcc, d’après les séquences génomiques disponibles sur www.burkholderia.com, a été étudiée et montre que : (1) seulement certaines espèces de Bcc possèdent l’opéron hmqABCDEFG au sein de leur génome, (2) au sein d’une même espèce toutes les souches ne possèdent pas nécessairement l’opéron. Afin de confirmer les analyses bioinformatiques, une étude exhaustive de la présence de l’opéron hmqABCDEFG (par PCR avec des amorces dégénérées visant des régions fortement conservées des gènes hmqA et hmqG) et de la production de HMAQ à partir d'une culture bactérienne dans un bouillon de soja tryptique (par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC/MS)) ont été effectuées sur 245 souches de Bcc majoritairement cliniques et appartenant à 18 espèces sur 21 espèces de Bcc. Parmi les cinq familles de HMAQ connues, les HMAQ-C7:1 et HMAQ-C9:1 sont majoritairement produites par les Bcc. Sur les 245 souches étudiées, 43 souches possèdent l’opéron hmqABCDEFG d’après les études PCR et 35 de ces souches produisent des HMAQ dosables par LC/MS. Ces résultats indiquent que la majorité des espèces ayant l’opéron hmqABCDEFG dans leur génome sont capables de produire des HMAQ connues. L’étude de la transcription du gène hmqA , par qRT-PCR - chez les souches porteuses de l’opéron hmqABCDEFG mais chez lesquelles des HMAQ n’ont pas été détectées - montre que (1) l’opéron hmqABCDEFG n’est pas exprimé dans les conditions de culture testées, (2) suggère que ces souches ne produisent pas de nouvelles HMAQ et (3) que le système Hmq est régulé différemment selon les souches.

Une étude approfondie de la régulation de l’opéron hmqABCDEFG et du rôle des HMAQ permettra de déterminer si les HMAQ sont impliquées dans la virulence des Bcc comme l’est le PQS chez P. aeruginosa. 

 

LES ADHESIONS FOCALES SUR LES BACTERIES LORS DU GLIDING SONT STABILISEES PAR DES ADHESINES ACCESSOIRES SURFACES DEPENDANTES


Nicolas JOLIVET1, Salim T. ISLAM1,2, Laura FAURE2, Gaurav SHARMA3, Mitchell SINGER3, Tam MIGNOT2
1INRS-Institut Armand-Frappier 2CNRS -- Laboratory of Bacterial Chemistry 3University of California

La motilité de surface de type gliding des bactéries et de certain de parasites protozoaires implique un liens avec le substrat via des adhésines (récepteurs protéiques au rôle d’adhésif) exposées à la surface des cellules. Le modèle d’étude Myxococcus xanthus est une bactérie Gram-négative capable de gliding. Elle utilise des intégrine-like proteins comme protéines d’adhésion. Une lipoprotéine membranaire, la protéine CglD, possède un rôle dans le gliding encore mal compris. 

Nous pensons son rôle dans le gliding est celui d'ancre à la surface et qu'elle est necessaire au gliding sur un type de surface spécifique.

Cette présentation présente l'étude du rôle d’une protéine de la membrane externe (CglD) impliquée dans la motilité de type gliding. Une étude bio-informatique, et notamment reconnaissance des structures secondaires montre que les motifs de CglD se divisent parfaitement en deux partie distinctes: l'extrémité C-terminale est homologue aux adhésines de la matrice extracelulaire, alors que la partie N-terminale, riche en site de fixation du calcium, présente une forte homologie avec une glycoprotéine adhésive. Cette double homologie avec deux systèmes d’adhésion différents semblent indiquer que la protéine CglD possède un rôle d’adhésion aux matrices extracellulaires. Des études microbiologiques ont été entreprises afin de mieux caractériser la fonction de cette protéine: des analyses de localisations et suivis des cellules ont indiqué que la protéine CglD n’a pas d’impact sur la vitesse de gliding, mais semble jouer un rôle dans les changements d’orientation, suggérant qu’il pourrait y avoir un lien entre la protéine CglD et le système cytoplasmique responsable de la polarité des cellules. De plus, une comparaison du gliding sur du chitosan entre la souche sauvage et une souche ΔcglD a montré une perte de motilité pour les deux souche. Néanmoins, on peut restaurer une motilité pour la souche sauvage en supplémentant en calcium. Cela semble indiquer à la fois qu’un domaine d’adhésion de CglD est requis pour certaines surfaces et que la prévision structurale de l’extrémité N-terminale semble être valide.

Ces résultats semblent valider le caractère accessoire de l'adhésine CglD mais ouvre de nouvelles interrogations concernant son liens avec le reste de la machinerie de gliding et son fonctionnement.

La compréhension de la machinerie de protéine de motilité permettra de mieux appréhender les interactions inter-microbiennes et pourra mener au développement de nouvelles thérapies pour traiter nombreuses maladies incluant l’obésité, le syndrome métabolique, les maladies du foie, et le cancer colorectal.

Les antimicrobiens modulent le Système de Sécrétion de Type VI de Vibrio cholerae


Candice Cros1, Marylise Duperthuy1
1Université de Montréal

Vibrio cholerae est une Gamma protéobactérie, colonisant aussi bien les environnements aquatiques marins que ceux d'eau douce et saumâtre. V. cholerae est l'agent étiologique du choléra, maladie toujours considérée comme problème majeur de santé publique et causant d'importantes diarrhées aqueuses, pouvant amener au décès du patient par déshydratation. Cette bactérie possède de multiples facteurs de virulence, les mieux caractérisés et les plus importants étant la toxine cholérique et le pilus corégulé avec la toxine (1). V.cholerae possède également d'autres facteurs de virulence incluant le Système de Sécrétion de type VI (SST6). Le SST6 est un système versatile qui permet à la bactérie d'injecter des toxines et autres effecteurs dans les cellules voisines, qu'elles soient eucaryotes ou procaryotes (2). De ce fait, le SST6 est impliqué aussi bien dans la virulence chez l'Homme que dans la compétition inter-bactérienne. La structure du SST6 ainsi que ses régulateurs sont relativement bien caractérisés (3). En revanche les signaux environnementaux permettant l'activation de ce système sont encore très peu connus. Chez V. cholerae, le seul signal identifié est la présence de 2% de chlorure de sodium (NaCl) dans le milieu, ce qui correspond à la salinité de l'eau de mer, son environnement naturel. De plus, lors d'épisodes infectieux de V. cholerae chez l'Homme, de grandes quantités d'électrolytes sont également libérées en raison des importantes diarrhées, augmentant ainsi la pression osmotique. Lors du processus infectieux, V. cholerae est en contact étroit avec le microbiote, dont certains membres sont capables de sécréter des molécules actives, incluant des peptides antimicrobiens (PAM) et des antibiotiques (ATB). Ces derniers sont également retrouvés dans l'environnement à des doses sous-létales (4). L’objectif de cette étude est de déterminer si la présence de PAM et d’ATB, à faibles concentrations, peuvent moduler l’expression et la sécrétion par le SST6.

Afin de déterminer l’impact de faibles concentrations en antimicrobiens sur le SST6, nous avons réalisé des analyses de protéomique globales et ciblées, par spectrométrie de masse et par immuno- buvardage. Pour cela, nous avons cultivé la souche A1552 de Vibrio cholerae en présence de différentes concentrations sous-inhibitrices en PAM et ATB et évalué le degré d'expression et de sécrétion du SST6. Pour les analyses par immuno- buvardage, nous avons en utilisant un anticorps anti-Hcp, une des protéines structurales du SST6 également sécrétée par celui-ci. Nos résultats montrent que certains antimicrobiens sont capables de réprimer la sécrétion par le SST6 alors que d'autres activent fortement son expression et la sécrétion de ses effecteurs spécifiques. Nous avons évalué si l’activation du SST6 a un rôle dans la résistance à ces antimicrobiens. La détermination des concentrations minimales inhibitrices ainsi que des dénombrements bactériens après un court contact avec des concentrations élevées en antimicrobiens chez la souche sauvage ainsi que chez le mutant n’ayant plus de SST6 fonctionnel n’ont pas permis de mettre en évidence un rôle du SST6 dans la résistance aux PAM et ATB. D’autre part, nous avons évalué l'impact de la répression ou de l'activation de la sécrétion par le SST6 sur la compétition bactérienne. Pour ce faire, des mises en contact de V. cholerae, en condition d’activation du SST6, avec Escherichia coli, bactérie dépourvue de SST6, ont été réalisées. Les résultats préliminaires de dénombrement des bactéries survivantes semblent indiquer que la modulation du SST6 en présence de PAM et ATB ne modifierait pas la capacité de V. cholerae à compétitionner Escherichia coli. L’étude des voies de régulation impliquées dans la modulation de l’expression et de la sécrétion via le SST6 par les antimicrobiens est actuellement à l’étude au laboratoire.

Cette étude nous a permis de mettre en évidence que de faibles doses en antimicrobiens sont capables d’induire ou d’inhiber le SST6 de Vibrio cholerae. Cependant cette modulation ne semble pas avoir pour but la résistance aux antimicrobiens. D’autre part, dans les conditions testées au laboratoire, nous n’avons pas pu établir de lien entre la modulation du SST6 et la capacité de Vibrio cholerae à éliminer E. coli.

(1) Kaper, J.B., et al., 1995

(2) MacIntyre, D. L., et al., 2010.

(3) Joshi, A., et al., 2016.

(4) Larsson, D.G.J., 2014.

L’adhésion de Caulobacter crescentus sondée à l’échelle moléculaire par microscopie à force atomique


Cécile Berne1,2, Yves Brun1,2
1Department of Biology, Indiana University, Bloomington, IN 47405, USA 2Département de microbiologie, infectiologie et immunologie, Université de Montréal, C.P. 6128, succ. Centre-ville, Montréal (Québec) H3C 3J7

Contrairement à d’autres bactéries qui adhèrent aux surfaces grâce à une matrice de biopolymères extracellulaires, Caulobacter crescentus utilise une adhésine uniquement localisée au pôle de la cellule : le holdfast. La force d’adhésion du holdfast est extrêmement élevée (plus de 3 fois plus adhésif que la colle Super Glue), mais la nature de cette adhésion n’est pas élucidée à ce jour. Le holdfast est un biomatériau ayant les propriétés d’un gel, composé en partie de polymères de β-1,4 N-acetyl-glucosamine (NAG).

Dans ces travaux, nous utilisons un microscope à force atomique (AFM) pour caractériser les mécanismes d’adhésion du holdfast au niveau moléculaire. Nous utilisons des holdfasts purifiés, ce qui permet de caractériser les propriétés intrinsèques du holdfast comme biomatériau, sans être influencé par la présence de la bactérie. La force d’adhésion du holdfast sur une surface augmente de façon logarithmique en fonction du temps, et le holdfast devient de plus en plus rigide, suggérant un mécanisme de « curing ». L’adhésion initiale du holdfast est également dépendante du degré d’hydrophobicité et de la rugosité de la surface. Nos résultats montrent aussi que le holdfast est un biomatériau hétérogène organisé en deux couches distinctes : un noyau rigide enveloppé d’une couche clairsemée de biopolymères flexibles, la « brush layer ». Enfin, nous montrons que le holdfast est composé, en plus des molécules de NAG déjà identifiées dans le passé, de peptides et de molécules d’ADN. Nos données suggèrent que les peptides sont les composés les plus importants pour la force d’adhésion du holdfast, alors que les molécules d’ADN sont plutôt impliqués dans la composition de la brush layer et dans l’intéraction initiale avec la surface, et que les molécules de NAG jouent un rôle dans l’architecture et l’intégrité du holdfast.

La structure complexe et hautement organisée du holdfast lui confère probablement son caractère d’adhésine universelle si efficace pour adhérer à des surfaces diverses. Ces travaux nous permettent de définir un peu plus les propriétés mécano-physiques du holdfast, et donc de comprendre comment les bactéries sont capables de coloniser des environnements très variés.

L’importance du séquençage à longues lectures pour la caractérisation de génomes complexes tel que celui de l’agent pathogène Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida


Marie-Ange Massicotte1, Antony Vincent1, Katherine Tanaka1, Mélanie Trudel1, Sabrina Attéré1, Valérie Paquet1, Anna Schneider1, Michel Frenette1, Steve Charette1
1Université Laval, IBIS

Chez la bactérie Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida (A. sal.), un agent pathogène aquatique, les plasmides sont présents en grande abondance et diversité. Ils peuvent apporter des avantages non négligeables à la bactérie tel que des gènes codant pour des résistances aux antibiotiques ou pour des facteurs de virulence. Toutefois, la caractérisation de nouveaux plasmides peut être considérablement limitée en raison de la présence de nombreuses régions répétées dans le génome d’A. sal. En effet, lorsque des technologies de séquençage à courtes lectures sont utilisées, ces régions répétées rendent non seulement impossible l’obtention d’un assemblage sans brèche, mais peuvent également empêcher la découverte de nouveaux plasmides, particulièrement s’ils partagent de longues régions avec d’autres plasmides. Cette problématique peut cependant être contournée avec l’utilisation du séquençage à longues lectures, tel que le séquençage à molécule unique de type PacBio (Pacific Biosciences) ou MinION (Oxford Nanopore Technologies). Ces types de technologies, générant des lectures beaucoup plus longues, facilitent l’assemblage et permettent l’obtention de génomes entiers.

 

Dans cette étude, nous présentons un résumé de nos travaux où l’utilisation du séquençage à longues lectures nous a permis d’identifier et de caractériser quatre plasmides d’A. sal., nommés pAsa8 (111 kb), pAsa9 (76,7 kb), pAsa5-3432 (180 kb) et pAsa6-like (27kb). La séquence du plasmide pAsa8, porteur de multiples gènes de résistance aux antibiotiques, a été obtenue grâce au séquençage MinION. Les trois autres plasmides (pAsa9, pAsa5-3432 et pAsa6-like) ont tous été séquencés par le biais de la technologie PacBio. Étonnamment, ces derniers sont tous dérivés du grand plasmide pAsa5 (155 kb) porteur de gènes obligatoires à la virulence d’A. sal. Alors que pAsa9 et pAsa6-like sont des dérivés de plus petite taille de pAsa5, pAsa5-3432 représente un cas particulier où le plasmide pAsa5 a acquis une part importante du plasmide pAsa8 qui code pour de multiples résistances aux antibiotiques. La découverte de ces plasmides démontre l’importance du séquençage à longues lectures pour caractériser complètement le génome de bactéries possédant un plasmidome complexe, tel que A. sal.

Modulation de la multicellularité bactérienne via différents polysaccharides sécrétés.


fares saidi1, Israel vergara2, Emilia M.F. Mauriello2, Salim Timo Islam1
1INRS-Institut Armand-Frappier 2CNRS – Laboratoire de chimie bactérienne, Marseille, France

Le développement de la multicellularité est une transition évolutive indispensable permettant une différenciation des fonctions physiologiques au sein d'une même population cellulaire, conférant des avantages en termes de survie. Chez les bactéries unicellulaires, cela peut conduire à des comportements développementaux complexes et à la formation de structures communautaires supérieures. Cependant, les connaissances concernant les déterminants de la multicellularité bactérienne sont limitées. Ici, nous démontrons chez une δ-protéobactérie Myxococcus xanthus, bactérie sociale, la sécrétion d’un nouveau polysaccharide aux propriétés biosurfactante (BPS) modulé spatialement et temporellement au sein des communautés joue un rôle dans la régulation de migration d'essaims et de prédation d'autres bactéries, ainsi que la formation de biofilms multicellulaires et de la formation des spores. Il a été démontré que la biosynthèse du BPS titrait la propriété adhésive de l’exopolysaccharide (EPS) à la surface des cellules végétatives intervenant dans les différents types de motilité des M. xanthus via une augmentation de l’hydrophobicité. Le BPS et EPS sont produits et sécrétés via des voies Wzx/Wzy-dépendants distinct de celle responsable de l’assemblage de la couche de spores. Ces travaux montrent l’importance centrale des polysaccharides sécrétés dans des comportements complexes qui coordonnent la multicellularité bactérienne.

Optimisation de la production de rhamnolipides par la bactérie Burkholderia thailandensis par évolution dirigée


sarah martinez1, Eric Déziel2
1IAF 2INRS-Institut Armand-Frappier

Problématique.

La majorité des agents tensioactifs sont produits par des voies synthétiques dérivées de l’industrie chimique. Les rhamnolipides sont des biosurfactants d’origine bactérienne présentant d’excellentes propriétés tensioactives, une faible toxicité et une biodégradabilité élevée. Ils sont principalement étudiés chez l’espèce pathogène Pseudomonas aeruginosa, mais les bioprocédés industriels mis en place à partir de cette bactérie présentent toujours un défi économique à cause des coûts associés à leur production et à leur purification.

 

Hypothèses.

Burkholderia thailandensis est une autre bactérie produisant des rhamnolipides et présentant l’avantage d’être non-pathogène. De plus, elle produit un seul congénère majoritaire, au contraire de P. aeruginosa, facilitant les étapes de purification subséquentes à la biosynthèse. Dans une optique d’optimisation, une souche prototype a été modifiée en appliquant le principe d’évolution dirigée, basé sur une pression de sélection résidant dans la tension de surface durant le phénomène de swarming.

 

Méthodologie.

B. thailandensis est capable d’un mouvement coordonné sur milieu semi-solide, appelé swarming, nécessitant la présence d’un flagelle et la production de rhamnolipides. Par des rondes successives de swarming, B. thailandensis a été soumise à une évolution accélérée, sur différentes concentrations d’agar,  afin de faire apparaître des mutations en faveur d’une surproduction de rhamnolipides. Un criblage des populations résultantes a été réalisé pour sélectionner phénotypiquement des mutants intéressants. Les rhamnolipides ont ensuite été quantifiés par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. Enfin, deux clones par lignées ont été choisis et leur génome séquencé pour identifier les sites mutés, amenant à un phénotype hyperswarmer et surproducteur de rhamnolipides.

 

Résultats.

Cette approche a mis en évidence des mutants intéressants, produisant jusqu’à quatre fois plus de rhamnolipides que la souche sauvage. Le séquençage du génome des mutants a permis l’identification de la position des mutations générées par le protocole d’évolution dirigée. Trois des six mutants séquencés ont montré des mutations dans le même gène, mais à des positions différentes, indiquant que ce gène jouerait un rôle important dans la régulation de la biosynthèse des rhamnolipides.

 

Conclusion.

L’augmentation de la production de rhamnolipides traduit une modification de la souche en faveur du développement d’un bioprocédé et permet d’envisager une production à plus grande échelle. La suite des travaux impliquera l’optimisation du milieu de culture afin de maximiser la biosynthèse.

Pan-génome de Pseudomonas aeruginosa : structure de population, le transfert horizontal des gènes et pathogénicité


Luca Freschi1, Anthony Vincent1,2,3, Julie Jeukens1, Jean-Guillaume Emond-Rheault1, Irena Kukavica-Ibrulj1, Marie-Josée Dupont1, Steve J. Charette1,2,3, Brian Boyle1, Roger C. Levesque1
1Université Laval, IBIS 2Centre de Recherche de l’Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec (CRIUCPQ), Québec 3Departement de Biochimie, De Microbiologie et de Bio-informatique, Université Laval, Québec

L’explosion récente de l’accessibilité aux séquences d’ADN génomique bactériens nous a amené à investiguer le pan-génome, qui se définit par l’ensemble complet des gènes pour un clade ou une espèce bactérienne. Dans la présente étude, nous avons utilisé 1,311 génomes de qualité du pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa. Parmi ces génomes, 619 ont été séquencés dans notre laboratoire. Le but était de montrer qu‘en utilisant un nombre important de données on peut définir la structure populationnelle et la diversité de P. aeruginosa, les limites de l’espèce et générer des hypothèses concernant l’évolution de sa pathogénicité. Les 665 gènes du core-génome de P. aeruginosa présentés dans cette étude constituent seulement 1% du pan-génome entier. Ces 665 gènes représentent donc une estimation conservatrice du core génome actuel et est comparable au nombre de gènes requis pour un génome bactérien minimal. De plus, la phylogénie basée sur ce core-génome fournit une preuve solide de l’existence d’une structure constituée de 5 groupes fonctionnels ou clades, incluant 2 clades nouvellement identifiés qui étaient absents des études précédentes probablement à cause d’un échantillonnage génomique limitée. 

 

En utilisant une approche de génomique comparative orientée sur la résistance aux antibiotiques et la virulence microbienne, nous montrons que la variation entre les isolats bactériens est partiellement liée avec la structure de la population. Nos résultats révèlent que le transfert horizontal de gènes joue un rôle important dans l’évolution de l’espèce. Nous avons identifié plus de 3,010 plasmides putatifs complets ou fragmentés, contenant des gènes de résistance ou de virulence à des fréquences de 5% et de 12% respectivement. Ces plasmides représentent des vecteurs importants pour le transfert de gènes.

 

Ces résultats constituent une quantité massive de données qui permettent d’identifier les trajectoires évolutives de la résistance et de la virulence chez P. aeruginosa. L’apprentissage machine pourrait utiliser cette information pour développer des méthodes prédictives.

 

Production et identification du biosurfactant inconnu de Burkholderia cenocepacia


Xavier Perron1, Margaux Lustig1, Donat Mokono1, Eric Déziel1
1INRS-Institut Armand-Frappier

Burkholderia cenocepacia est un pathogène opportuniste faisant du complexe Burkholderia cepacia (BCC). Le BCC est constitué d’un ensemble d’espèce apparentée incluant plusieurs pathogènes opportuniste colonisant les poumons des individus atteints de la fibrose kystique que l'on retrouve dans le sol et qui possèdent une résistance intrinsèque envers de nombreux antibiotiques. Les rhamnolipides sont des agents mouillants qui abaisse la tension de surface et permettent la motilité sociale de type swarming en présence d'un flagelle fonctionnel. Tout comme les pathogènes Burkholderia pseudomallei et Pseudomonas aeruginosa, qui produisent des rhamnolipides, B. cenocepacia possède des homologues des gènes rhlA/rhlB/rhlC (environ 80% d'homologie avec ceux de B. pseudomallei) qui permettent de produire, théoriquement, des rhamnolipides. Cependant, malgré nos méthodes de caractérisation et d’identification par spectrométrie de masse, nous n’avons pas été en mesure de détecter un rhamnolipide ou un tout autre biosurfactant chez B. cenocepacia. Néamnoins, un mutant sans le gène rhlA perd sa motilité de type swarming, ce qui confirme qu’un agent mouillant qui dépend des gènes rhl serait effectivement produit par cette espèce de BCC. Les résultats obtenus jusqu'à présent nous permettent de confirmer la production du biosurfactant sur gélose sang et sur gélose Nutrient Broth contenant 0,5% dextrose, sans toutefois être en mesure de le purifier et de l’identifier. Le premier objectif de ce projet est donc de déterminer les conditions de cultures optimales pour la production de ce biosurfactant via l'opéron rapporteur luxCDABE lié au promoteur de l'opéron de rhlABC pour corréler la production du biosurfactant avec l’activité du rapporteur. Notre hypothèse est qu'en optimisant le milieu de culture, il sera possible de maximiser la production du biosurfactant inconnu en concentration suffisamment élevée pour permettre son identification et sa caractérisation physico/biochimique et structurale. Selon les résultats obtenus, ce nouveau biosurfactant pourrait permettre de mieux comprendre la pathologie des BCC, et même potentiellement avoir des applications industrielles puisque certaines BCC sont biosécurité 1.

Propriétés émergentes lorsque Pseudomonas aeruginosa et Burkholderia cenocepacia sont co-cultivés


May Landry1, Eric Déziel1
1INRS-Institut Armand-Frappier

 Les microorganismes peuvent coexister de manière stable ou compétitive en fonction de leur environnement. De nombreuses stratégies sont employées par les bactéries pour faciliter l’acquisition de ressources et favoriser leur survie dans un lieu donné, tel que l’utilisation de la motilité. Les bactéries peuvent se déplacer de différentes façons, notamment en réalisant le swarming. Ce dernier consiste en un mouvement de groupe rapide et coordonné sur une surface gélosée semi-solide. Pour effectuer cette motilité, deux caractéristiques sont indispensables, soit la production d’un agent mouillant et la présence d’au moins un flagelle fonctionnel. Les bactéries Pseudomonas aeruginosa et Burkholderia cenocepacia sont deux microorganismes capables de se déplacer en swarming. On les retrouve parmi la communauté microbienne diversifiée des voies respiratoires des individus atteints de fibrose kystique. Des études indiquent que la présence de ces deux pathogènes induiraient une infection plus grave et un traitement ardu. Nous avons donc investigué les possibles avantages de la motilité swarminglorsque ces organismes se retrouvent en co-culture. Dans nos conditions, la souche B. cenocepacia K56-2 ne démontre pas de motilité. Lorsque cette dernière est mise en co-culture avec P. aeruginosa PA14, on  note qu’elle est capable de suivre cette dernière dans le patron de swarming, suggérant que P. aeruginosa fournit un élément manquant à B. cenocepacia. De plus, des co-cultures avec un mutant non-motile fliC- de PA14 (déficient en flagelle) a néamnoins révélé sa présence aux extrémités des dendrites du patron swarmingà plus forte densité que K56-2. Ces résultats indiquent qu’un mécanisme d’attachement («hitchiking») pourrait avoir lieu entre les deux organismes lors de la motilité swarming leur permettant d’effectuer une collaboration. Des souches de PA14 mutantes de différents appendices impliqués dans l’adhérance et/ou la locomotion telles que chez les pili cup et les pili de type IV ont aussi été testées afin d’élucider comment ces deux bactéries collaborent. Ces travaux pourraient nous permettre d’en apprendre plus sur les interactions entre ces organismes lorsqu’ils se retrouvent dans les poumons des patients co-infectés ou lorsqu’ils sont retrouvés sous forme de biofilms dans l’environnement.

Rapid multicellular cell shape evolution: lesson form Neisseriaceae family


Sammy Nyongesa 1, Juan Guerra 1, Antony Vincent 1, Frédéric J. Veyrier 1
1INRS-Institut Armand-Frappier

The bacterial cell shape is a conserved trait that directs the adaptation and colonisation of bacteria to different environments.  Members of the Neisseriaceae family have a great diversity of forms, ranging from bacilli, cocci, and some with a multicellular arrangement. Using an evolutionary approach, we have previously demonstrated that the cocci form adopted by the two major pathogens, N. meningitidis and N. gonorrhoeae, emerged from a bacilli ancestor upon the loss of yacF gene where we showed its implication in bacterial cell division. We are currently using a similar approach to determine the molecular and evolutionary mechanisms that allowed cell shape transition from bacilli to multicellular organisation. We employed PacBio long read sequencing to obtain complete and closed genomes for different cocci, bacilli, and multicellular Neisseriaceae. Comparative genomic analysis using MycoHIT showed that some conserved genes were lost in multicellular Neisseriaceae such as S. muelleri and A. filiformis. Interestingly we found that 50% of these genes encode proteins that are important in determining the bacterial cell shape such as the conserved cell division protein MraZ, the peptidoglycan transglycosylase MtgA and the RNAse adaptor protein RapZ. In this presentation, we focus on determining the role of the MraZ regulator in the Neisseriaceae family. We used two approaches, first we constructed MraZ null and MraZ over expressing strains from a bacilli shaped model Neisseria elongata. We also used 9 different Neisseriaceae species, three for each morphology (bacilli cocci and multicellular). RNA was extracted from the strains and transcriptomic analysis done by RNA sequencing. Altogether, our results show that MraZ is an activator of the dcw cluster (genes in the division and cell wall cluster such as MraW, PenA and MurE were significantly downregulated in the absence of MraZ gene and upregulated in its presence). Its over-expression led to shorter cells. Therefore, we think that the loss of this gene might contribute to the irregular and incomplete cell division in multicellular Neisseriaceae. We are confident that this panoramic view of the evolution of the cellular form of Neisseriaceae will help to better understand the bacterial multi-cellularity and how some species adapt preferentially to certain hosts or regions of the body but also will help to reveal common features of cell cycle in the Neisseriaceae family.

Régulation des fimbriae de type 1 chez les Escherichia coli uropathogènes


Hicham Bessaiah1,2, Malek Nefzi1, Sébastien Houle1,2, charles M dozois1,2
1INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Québec, Canada 2Centre de recherche en infectiologie porcine et avicole (CRIPA), Université de Montréal, Faculté de Médecine Vétérinaire, Saint-Hyacinthe, Québec, Canada

Les E. coli uropathogènes (UPEC) sont la principale cause des infections du tractus urinaire (ITU). Les fimbriae de type 1, codés par les gènes fim, sont hautement conservés chez les isolats d’E. coli et sont l'un des facteurs de virulence les plus importants impliqués dans la pathogenèse des ITUs. Les fimbriae type 1 pourraient aussi contribuer à la virulence des E. coli pathogènes aviaires (APEC). Le groupe de gènes pst code pour le système de transport spécifique au phosphate (Pst). L'inactivation du système Pst active de manière constitutive le système de régulation à deux composantes PhoBR et atténue la virulence des bactéries pathogènes. Chez la souche UPEC CFT073, l'atténuation par inactivation de pst est principalement due à la diminution de l'expression des fimbriae type 1. Dans ce projet de recherche, nous nous intéressons à comprendre davantage la régulation des fimbriae type 1 chez la souche CFT073, lié ou non au système Pst. Pour déterminer les facteurs impliqués dans l'expression des fimbriae type 1, nous avons développé un système rapporteur luciférase (système lux) à simple copie fusionnée à la région promotrice de l’opéron fim, qui est situé sur un élément inversible, fimS. L’utilisation du système lux permet de mesurer l'activité des promoteurs et d'autres éléments régulateurs de la transcription, ainsi que les effets des activateurs et des inhibiteurs. Dans ce contexte, nous avons généré trois banques de mutants par transposition chez la souche CFT073, le mutant pst et la souche sauvage avec une fusion transcriptionnelle du promoteur fimS verrouillé en phase ON. Nous avons par la suite criblé les mutants générés par le transposon Tn10 pour le niveau de production des fimbriae type 1 suivi de séquençage à haut débit afin d'identifier des gènes qui, lorsqu'ils sont altérés, affectaient l'expression des fimbriae de type 1. Plusieurs gènes ont été identifiés qui semblent affecter l’expression de fimbriae type 1. Nous avons montré que yqhG, codant pour une protéine de fonction inconnue, est l’un des médiateurs importants contribuant à une diminution de l’expression des fimbriae de type 1 chez la souche CFT073. Nos résultats démontrent que la délétion de yqhG altère l'expression des fimbriae de type 1 et diminue significativement la capacité du mutant yqhG à coloniser le tractus urinaire murin. De plus, l’atténuation de la virulence du mutant yqhG est concomitante avec la répression de l’expression des fimbriae de type 1.  Afin de comprendre dans quelle mesure YqhG affecte la virulence des UPEC. Nous avons démontré que le mutant yqhG est plus sensible au stress oxydatif. La répression l'expression des fimbriae de type 1 chez le mutant yqhG pourrait être liée à une augmentation de la sensibilité aux stress environnementaux qui pourrait être rencontrés au cours de l'infection de l'hôte et conduire à des modifications de la surface cellulaire.

Rôle des toxines Stx dans la réponse d’Escherichia coli entérohémorragique O157:H7 à l’irradiation


Ghizlane Gaougaou1, Antony Vincent2, Katerina Krylova3, Hajer Habouria4, Amina Baraketi5, Frederic Veyrier6, Charles Dozois7, Éric Déziel8, Monique Lacroix9
1IAF-INRS 2IAF-INRS 3IAF-INRS 4IAF-INRS 5IAF-INRS 6IAF-INRS 7IAF-INRS 8IAF-INRS 9IAF-INRS

Escherichia coli (E. coli) O157:H7 fait partie des principaux agents responsables d’intoxications alimentaires. C’est un pathogène capable de produire deux toxines de type Shiga (Stxs), soit Stx1 et Stx2, codées respectivement par les deux prophages CP-933V et BP-933W. Toutefois,  comme la majorité des agents pathogènes, E. coli O157:H7 peut survivre aux stress utilisés par les industries alimentaire pour éliminer les agents pathogènes comme l’irradiation. Nous avons déterminé le mécanisme de radio-résistance d’E. coli O157:H7 via l’adaptation de cette bactérie à la dose ‘’létale’’ d’irradiation (1,5 kGy). Six passages à 1.5 kGy ont favorisé la sélection de mutants résistants. Le séquençage du génome de trois clones résistants (C1, C2 et C3) a révélé la perte de CP-933V et de BP-933W et la mutation de trois gènes : rpoA, wrbA et un gène codant pour une protéine hypothétique (Wt_02639). Les trois clones adaptés sont devenus résistants au stress oxydatif (paraquat), sensibles au pH acide (pH 2) et moins cytotoxique. Remarquablement, il a été possible de réinfecter le clone C1  avec BP-933W, et ce dernier a réintégré le génome d’E. coli O157:H7  mais pas dans son site spécifique wrbA qui était muté. Non seulement ce clone (C1-Φ) est redevenu sensible à l’irradiation, mais il a également regagné sa cytotoxicité, sa sensibilité au stress oxydatif et sa résistance à l'acidité. De plus,  la souche non pathogène MG1655 de E. coli K-12 ayant intégrée BP-933W dans son génome est devenue cytotoxiques, sensible à l’irradiation et au stress oxydatif et légèrement plus résistantes à l'acidité. Mis ensemble, ces résultats indiquent que les prophages jouent un rôle fondamental dans la réponse d’E. coli O157:H7 aux stress tel l’irradiation. Certains traitements utilisés pour décontaminer les aliments peuvent provoquer le transfert horizontal des prophages d’une bactérie sensible et pathogène à une autre résistante et non pathogène. 

SalmoSeq, un outil moléculaire pour identifier rapidement la présence de Salmonella et prédire son niveau de virulence


Jean-Guillaume Emond-Rheault1, Alanna Crouse2, Maude Kerhoas3, Jérémie Hamel1, Irena-Kukavica-Ibrulj 1, Samantha Gruenheid2, Danielle Malo2, France Daigle3, Lawrence D. Goodridge2, Brian Boyle1, Roger C. Levesque1
1Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes 2McGill University Research Centre on Complex Traits 3Département de microbiologie et Immunologie, Université de Montréal; Faculty of Agriculture and Environmental Sciences, McGill University

L’identification de la bactérie d’origine alimentaire Salmonella enterica et de son potentiel pathogène et épidémique est basé sur des méthodes traditionnelles de sérotypage et d’analyses biochimiques qui requièrent de 6 à 10 jours. Plusieurs méthodes diagnostiques de séquençage de nouvelle génération ("whole genome sequencing", WGS) et de "polymerase chain reaction" (PCR) ont déjà été proposées. Les méthodes standards de microbiologie ainsi que moléculaires rencontrent diverses limitations en regard du coût, de la spécificité, des contraintes de temps et elles n’indiquent pas le degré de virulence. Dans la présente étude, nous avons développé SalmoSeq, une technique basée sur l’AmpliSeqTM combinant le PCR et le séquençage de nouvelle génération pour détecter la présence et prédire la virulence de Salmonella. SalmoSeq s’avère rapide, peu coûteux et permet de prédire le pouvoir pathogène de Samonella.

L’une des difficultés majeures lors de la conception de l’AmpliSeqTM pour le diagnostic de maladies infectieuses est le manque de données biologiques sur la virulence et autres phénotypes d’intérêts afin de faire des liens clairs avec la génomique. La majorité des tests moléculaires s’appuient sur des prédictions bio-informatiques et des données biologiques résultantes d’expérimentations variées tirées de la littérature. Nous avons développé une stratégie complète sans a priori basée uniquement sur les données biologiques de trois modèles d’infections pour assigner un degré de virulence high ou low aux isolats de Salmonella. Les données de pathogénicité ont été combinées aux données de génomiques et analysées par des méthodes de statistique standard dans l’objectif de prédire à > 99% la virulence chez Salmonella.

Les résultats des modèles d’infection de 40 isolats de salmonelles classés de virulence high (n = 21) et low (n = 19) ont été combinés à leur WGS de haute qualité afin de trouver des régions génomiques corrélant fortement avec leur virulence. Les génomes ont été fractionnés en séquence de 31 nucléotides appelée kmers (2,59x107 kmers pour 40 génomes). Les analyses statistiques des kmers entre les isolats de virulence high et low montrent 49 231 kmers significatifs répartis dans plus de 100 gènes, révélant différentes cibles prometteuses pour l’AmpliSeqTM de Salmonella.

SalmoSeq, qui est basé sur l’association des Kmers avec la virulence chez Salmonella, a été estimée être la meilleure méthode diagnostique pour identifier rapidement et à faible coût ce pathogène. En plus de sa simplicité d’utilisation et de sa rapidité, SalmoSeq sera capable d’identifier > 99% isolats de Salmonella ainsi que de prédire leur niveau de virulence.

Structure and localization of ESX-3 in Mycobacteria


Isabelle Morneau1, DOAA FAKIH1, Driss Lajoie1
1University of Montreal

The complex ESX-3 is the most conserved of the five systems of secretion type VII, called ESX-1 to ESX-5, present in Mycobacteria. It is implicated in iron transport and in secretion of esx-H protein, which interacts with ESCRT machinery in the macrophage. By combining Fast-Liquid Protein chromatography (FPLC) and Single Particle analysis, we have reconstructed an In Vitro model that contains three proteins of the ESX-3 cluster. We also have used Correlative light and electron microscopy (CLEM) and PALM microscopy to localize and identify a putative In Vivo structure in tomograms of M.marinum. Both structures would give us important tools to analyze the mechanism of the ESX-3 machinery and could be used for inhibitors screening.

Structure et mode d’action des transporteurs membranaires du nickel chez Helicobacter pylori


Imène Kouidmi1, Ines Feriel1,2, Mariem Chalbi1, Charles Calmettes1
1INRS-IAF 2UQAM

Helicobacter pylori est un pathogène humain qui colonise l’estomac et provoque plusieurs maladies dont les ulcères et cancers gastriques. Plus de la moitié de la population mondiale est infectée par H. pylori, on estime que 1 à 3% des personnes infectées développeront un cancer gastrique. L’éradication de H. pylori est la première ligne de traitement contre les maladies gastriques. Cependant, cette thérapie, basée principalement sur l’utilisation d’antibiotiques, n’est pas totalement efficace. De plus, l’émergence de souches résistantes a augmenté de manière dramatique ces dernières années. Il est donc important et urgent de développer des nouvelles stratégies de traitement. Pour résister à l’acidité et se multiplier dans l’estomac, H. pylori possède deux enzymes indispensables, l’uréase et l’hydrogénase. L’activité de ces facteurs de virulence est étroitement dépendante d’ions nickel qui ne sont présents qu’à très faible concentration chez l’humain. Pour ce fait, H. pylori possède des mécanismes d’acquisitions du nickel hautement efficaces pour assurer sa survie chez l’hôte. Plusieurs transporteurs de nickel ont été identifié chez H. pylori; on retrouve les transporteurs de la membarne externe, FrpB4 et FecA3, de la membrane interne NixA et NiuDE, et les protéines périplasmiques NiuB. Cependant, la structure et mode d’action de ces protéines ne sont pas encore connus. Le but de ce travail est de caractériser la structure des transporteurs membranaires du nickel et de déterminer les mécanismes moléculaires par lesquels le nickel est transporté. De plus, une étude récente a démontré que les sels de bismuth, un complexe organométallique utilisé dans le traitement des infections à H. pylori, empreinte la voie de transport du nickel pour pénétrer à l’intérieur de la bactérie. Ainsi, l’étude de la structure de ses transporteurs permettrait de mieux comprendre la spécificité des sels bactéricides de bismuth contre ce pathogène, et pourrait conduire à la conception d’une stratégie visant à améliorer davantage l’efficacité du traitement des infections à H. pylori.

THE INFLUENCE OF TREHALOSE METABOLISM ON EXPRESSION OF TYPE I FIMBRIAE IN EXTRA-INTESTINAL ESCHERICHIA COLI STRAIN MT78


Klemberg VS 1,2, Houle. S 2, Pavanelo DB 3, Horn. F 1, Dozois CM 2
1UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil 2INRS, IAF, Laval, Qc, Canada 3USP, São Paulo, SP, Brazil

Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) are responsible for a number of infections outside the gastrointestinal tract, including urinary tract infections and neonatal meningitis in humans and infections in poultry and other animals. In poultry, avian colibacillosis – as ExPEC infections are collectively called – causes great economic losses worldwide. Among the factors that can contribute to ExPEC infection, type 1 fimbriae can mediate adherence to and invasion of host cells. Previously, we determined that loss of the periplasmic trehalase, encoded by treA, contributed to a decrease in type 1 fimbriae expression and decreased virulence in a mouse urinary tract model, reduced adherence and invasion of avian fibroblasts (CEC-32 cell line) in ExPEC strain MT78. The enzyme trehalase, encoded by the treA gene, degrades the disaccharide trehalose in the periplasm; whereas otsA and otsB genes encode cytoplasmic enzymes required for trehalose biosynthesis. In E. coli K-12, the pathways of trehalose biosynthesis and degradation are involved in the response to osmotic stress. Under osmotic stress, K-12 accumulates trehalose by increasing the expression of treA, otsA and otsB. To elucidate whether it is the excess of trehalose in the periplasm that affects type 1 fimbriae expression, we generated isogenic mutants, MT78ΔotsBA and MT78ΔtreAΔotsBA using the lambda red recombinase technique. Since the MT78ΔtreA mutant show decreased type 1 fimbriae production and is more resistant to osmotic stress compared to wild type parent (Pavanelo et al, 2018). Further, we performed yeast agglutination and osmotic resistance stress tests to observe type I fimbriae expression. Bacterial cultures were grown under shaking for 24 hours until the mid-log phase (OD 600 nm ~ 0.6) in LB medium and were then tested for yeast agglutination by 2-fold dilutions. The most diluted yeast agglutination titers for bacteria were: a titer of 3 for the wild-type strain, a decreased titer of 2 for MT78ΔtreA and MT78ΔotsBA; and only a titer of 1 for the MT78ΔtreAotsBA. The higher titer of 3 was restored to MT78ΔtreAΔotsBA upon complementation with the treAotsAB genes. Resistance to osmotic stress was determined by growth of serially diluted cultures on LB plates with or without 0,6 M of urea. The wild-type, ΔotsBA and ΔtreaΔotsab reduced their growth 50-fold when compared to control growth. The Δtrea strain and the ΔtreaΔotsab complemented mutant were reduced by 40 and 30-fold, respectively. This result implies that loss of trehalose synthesis could play a role in type one fimbria production, although this did result in changes to osmotic stress resistance in the presence of 0.6 M urea. Altogether, our results suggest that deletion of otsBA and treA genes affect type 1 fimbriae expression. However, because the production of type 1 fimbriae in the treA mutant is not regained by the loss of the enzymes required to synthesize trehalose (OtsA and OtsB), the excess of trehalose in the bacterial periplasm from loss of TreA as well as the loss of synthesis of trehalose itself may both influence the production of type 1 fimbriae, which may alter virulence by other mechanisms that have yet to be elucidated.

Keywords: E. coli, treA, otsA, otsB, trehalose, type 1 fimbriae.

Un composé capable de pénétrer et de tuer spécifiquement les Neisseria pathogènes


Eve BERNET1, Marthe Lebughe 1, Robin VIDAL1, Golara Golbaghi1, Medhi HAGHDOOST1, Annie Castonguay1, Frederic veyrier1
1INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada

            Une grande diversité d’espèces compose la famille des Neisseriaceae. La majorité sont des commensaux buccaux mais deux espèces, dont le réservoir est strictement humain, sont pathogènes; Neisseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae. Elles sont présentes respectivement dans les muqueuses des voies respiratoires supérieures et des voies génitales de l'homme et de la femme. Même si la présence de ces bactéries est généralement asymptomatique, elles peuvent être à l'origine d'un large éventail de manifestations cliniques pouvant être mortelle. L'infection pouvant avoir d'énormes conséquences, il est impératif de fournir un traitement efficace. C'est pour cela que lors d’une infection symptomatique par ces bactéries, un traitement par antibiotique est prescrit. Cependant, les Neisseria ont une incroyable capacité de s'adapter rapidement pour faire face à la pression de leur environnement. La résistance aux antibiotiques ne fait malheureusement pas exception à la règle. Comme conséquence, des clones difficilement traitables voir non traitables émergent un peu partout dans le monde. Il est donc essentiel de trouver de nouveaux traitements permettant de contrer la résistance des Neisseria pathogènes, sans pour autant nuire aux non-pathogènes qui participent à l’immunité de groupe.

 

Les laboratoires du Professeur Frédéric VEYRIER (microbiologie) et Annie CASTONGUAY (chimie) se sont associés pour découvrir un nouveau composé bactéricide spécifique aux Neisseria pathogènes et sans toxicité pour les autres Neisseria ou les cellules eucaryotes. Ils ont criblé l’activité d’une banque de composés à faible poids moléculaire pour rechercher des inhibiteurs de Neisseria pathogènes. Ils seront ensuite optimisés par la synthèse de nouveaux analogues grâce à des procédés chimiques pour parvenir à une meilleure affinité et une meilleure spécificité. Après le crible de près de 2 000 composés, un seul groupe de molécules (arborant le motif BPh4-) répondait aux critères de sélection (bactéricide et spécifique). En effet, ils induisent la mort des deux espèces pathogènes sans être toxique pour les autres Neisseria. Nos résultats montrent grâce à l’utilisation de la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) que le BPh4- pénètre mieux dans les Neisseria pathogènes. De plus, même lorsqu’il pénètre dans les autres Neisseria (utilisation de forte dose) sa toxicité intracellulaire est moindre. Ceci implique que la spécificité provient d’une meilleure incorporation de la molécule mais aussi que le BPh4-  a une plus grande toxicité intracellulaire chez les Neisseria pathogènes. Nous essayons maintenant d'identifier les différentes cibles possibles de ce composé dans Neisseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae afin de comprendre son mécanisme d'action.

Nous pensons que le BPh4- peut être utilisé dans le design de nouvelles molécules thérapeutiques mais surtout, nous souhaitons utiliser ses propriétés pour comprendre et caractériser les différences entre les Neisseria pathogènes et les autres bactéries.

Un nouveau mécanisme de protection contre la recombinaison génétique anarchique chez Neisseria meningitidis ?


Martin Chenal1, Ahmed Khairalla1, Frederic veyrier1
1INRS-Institut Armand-Frappier

On retrouve dans la plupart des génomes procaryotes et eucaryotes une forte abondance de séquences répétées. Pourtant, l’origine ainsi que les fonctions de ces éléments ne sont pas entièrement expliquées. Plusieurs semblent être des artéfacts de transposition virale, d’autres ont été associés à des rôles structurels ainsi que de régulation de l’ADN, mais beaucoup d’autres demeurent un mystère.de ces séquences n’ont pas de fonction assignée. Le génome de la bactérie Neisseria meningitidis, l’agent responsable de la méningite bactérienne, possèdeprésente une abondance et une diversité exceptionnelle de séquences répétées. L’une d’elle, la DNA Uptake Sequence, confère au genre Neisseria la capacité d’incorporer de l’ADN exogène dans son génome par transformation. Cette compétence naturelle permet aux Neisseria une évolution rapide pour une meilleure adaptation rapide à leur environnement ainsi qu’une forte activité. De plus, cette compétence naturelle intervient aussi dans les phénomènes de réparation de l’ADN.

Dans cette étude, nous nous intéressons à une courte séquence répétée non-caractérisée. Celle-ci est présente en forte abondance autour de certains gènes essentiels ou de virulence dans le génome de Neisseria meningitidis, mais toujours à l’extérieur des cadres de lecture. De façon intéressante,  cette séquence se retrouve aussi répétée dans de nombreuses autres bactéries ce qui lui suggère une fonction régulatrice importante.. Nous avons identifié une protéine hypothétique,fortement associée à cette séquence répétée, que nous appelons GspA, qui se retrouve entourée quasi-systématiquement par cette séquence répétée dans plusieurs génomes bactériens. Notre hypothèse est que GspA interagirait avec la séquence répétée pour effectuer une fonction régulatrice. À l’aide d’études moléculaires et phénotypiques, nous démontrons ici que GspA est une endonucléase qui clive probablement la séquence répétée. En générant des souches dans lesquelles GspA est surexprimée ou délétéesupprimée, nous montrons que cette protéine est responsable d’une forte diminution de la compétence chez Neisseria meningitidis. Nous suggérons que GspA reconnaît et coupe les séquences répétées de l’ADN exogène, ce qui empêche sa recombinaison au génome. Ceci pourrait protéger certains gènes importants pour la bactérie d’une recombinaison trop anarchique. Nos résultats indiquent également un possible rôle de GspA dans la résistance à certains stress ainsi que dans la virulence.

Cette étude propose donc un nouveau mécanisme de régulation des échanges horizontaux de gènes dans Neisseria, en caractérisant à la fois une protéine et une séquence répétée auparavant inconnus.

Une nouveau modèle de synthèse du peptidoglycane : le « stalk »


Paul D. Caccamo1, Maxime Jacq1,2, Yves V. Brun1,2
1Indiana university 2Université de Montréal

Chez les bactéries, la morphologie et les modes de croissance sont interconnectés. La croissance bactérienne nécessite la synthèse de peptidoglycane (PG) de manière structuré et régulé spatialement. Les protéines requises pour la synthèse du PG sont souvent essentielles pour la survie de la bactérie, compliquant certaines approches expérimentales.  Afin de parer à ce problème, nous étudions un pédoncule bactérien non-essentiel (nommé stalk). En effet, la synthèse de ce pédoncule nécessite la synthèse zonale du PG afin de créer une projection de l’enveloppe cellulaire.

 

Alors que Caulobacter crescentus montre un pédoncule au niveau du pôle de la cellule, les espèces Asticcacaulis excentricus et Asticcacaulis biprosthecum exhibe une localisation pédonculaire sub-polaire ou bi-latérale respectivement, dépendant de la localisation de synthèse du PG. Jusqu’à présent, l’unique protéine décrite comme étant essentielle pour la synthèse et le positionnement du pédoncule est la protéine SpmX, une hydrolase présumée du PG.

 

Nous avons montré que la protéine cytosquelettique de la famille des Bactofilines BacA est requise pour la synthèse correcte du pédoncule chez A. excentricus et A. biprosthecum.

In vitro, ces protéines forment des filaments de manière spontanée. Lorsque BacA est absent, ces bactéries sont respectivement dépourvues de pédoncule ou exhibe des protubérances de l’enveloppe cellulaire au site de synthèse présumé du pédoncule (« pseudo-pédoncule »). Dans le mutant A. biprosthecum ΔbacA, la protéine SpmX se localise à l’extrémité de ces pseudo-pédoncules au lieu d’être présent à la base. Cette observation ainsi que la formation spontanée de filaments de BacA supporte l’hypothèse que BacA servirait en tant que protéine d’échafaudage (scaffolding) de la synthèse du pédoncule organisant un complexe de synthèse à la base de celui-ci et potentiellement recrutant de nouvelles protéines pour former un pédoncule fonctionnel.

UNMASKING KEY REGULATORS IN BACTERIAL HOST-TROPISM


Cecilia Nieves1, Antony Vincent1, Frederic veyrier1
1INRS-Institut Armand-Frappier

INTRODUCTION: Pathogen-host interactions can happen in different ways, being the most well-studied the parasitism, in which the pathogen generates injury in the host, altering its normal physiological state and leading to disease. In pathogenic associations, there are two kinds of pathogens, the so-called generalists, capable of infecting a wide range of host species, and specialists, which are only able to interact and infect single-host species. The main modulator of this tropism is the host itself. The elaborate network of molecular interactions between pathogens and hosts is responsible for this specificity, and it has been demonstrated mainly in viral pathogens. In bacteria, these interactions are more complex and involve more molecular and cellular entities, which makes difficult to understand the pathogen-host relationship. Several members of genera Leptospira and Mycobacterium have been associated to infection of particular hosts, leading to investigate which is the genetic background behind this specific adaptation. In the case of Leptospira, the scenario remain unclear given the high genetic variability among its species and the bias towards the sequencing of human isolates. For Mycobacterium, the expression of two immunogenic proteins, MPT70 and MPT83, regulated by a particular system of sigma factor/anti-sigma factor, SigK-RskA, in members of M. tuberculosis complex, has been largely studied and seems to be host-associated.

 

OBJECTIVE: To better understand the genetic background behind the evolution of two bacterial genera: Leptospira and Mycobacterium, in order to determine which mechanisms are involved in host-adaptation of its species. Taking into account only those strains that differentially infect bovines and humans, our goal is to investigate if there is a correlation between down- or up-regulated genes and how this may influence on the ability to infect specifically each host.

 

PRELIMINAR RESULTS: Mycobacterium: here, we show that a natural mutation in RskA blocks this SigK-regulator into an unsuspected activator of SigK, which leads to its over-expression, and, consequently, to an up-regulation of those genes whose expression is controlled by SigK. It has been shown that this activating function is widely distributed in this family of anti-sigma factors, and now, we are trying to understand the consequences of such constitutive expression of the SigK regulon in the tropism-host. Leptospira: recently, several genomes of leptospiral isolates from bovines have been sequenced, assembled and annotated. Currently, we are performing comparative analysis at genomic level between these isolates and those obtained from human, using different bioinformatics tools, such as myco-HIT and CapriB, in order to find proteins and/or amino acids changes that could be involved in host-adaptation.