Caractérisation de la réponse immunitaire au virus de la stomatite vésiculaire oncolytique dans le cancer de la vessie
Francis Bernier-Godon1
Caractérisation dynamique de l'environnement protéique de RAB21 via APEX2
Tomas Del Olmo
Clinical Outcomes of Patients (pts) with Human Epidermal Growth Factor Receptor 2(HER2) equivocal early breast cancer (EBC).
Alexandra Desnoyers
Effet de l’entraînement mixte sur le profil inflammatoire chez le patient oncogériatrique débutant un traitement contre un cancer curable
Parent-Roberge H
Étude des voies alternatives de réparation de l'ADN médiées par la recombinase RAD52
Jean-Christophe Dubois
Étude du récepteur à la laminine 67LR dans les cellules adénocarcinomateuses de côlon
Gabriel Cloutier
Étude rétrospective comparant l'issue à 10 ans chez les patients ayant subi une prostatectomie radicale par voie ouverte et laparoscopique
Sara Medina Kasasni
Formulation d’un puissant inhibiteur peptidique de l’enzyme PACE4, en vue d'une administration orale pour le traitement du cancer la prostate
Pauline Navals
Gliotrap: un nouveau traitement contre les tumeurs cérébrales primaires
Laurence Déry
Identification de Nouvelles E3 Ubiquitine Ligases Impliquées dans la Protection du Génome Humain
Billel Djerir
Identification of proteins regulated by SOCS1 through Mass Spectrometry using Stable Isotopic Labelling of Amino acids in Cell culture (SILAC)
Madanraj Appiya Santharam
Imagerie de perfusion et de perméabilité cérébrale pour le suivi clinique de métastases cérébrales
Benoît Bourassa-Moreau
Implication de la voie Hedgehog dans la résistance à l'anoïkose de cellules cancéreuses coliques
Blanche Senicourt
In-vitro cytotoxic effect of 64Cu/NOTA-terpyridine platinum complex, as a novel chemoradiation therapy (CRT) agent
Meysam Khosravifarsani
La L-PGDS et ses peptides dérivés, des GEFs de la GTPase Rab4?
Samuel Picard
Le 68Ga-4HMSA, un traceur TEP pour l’imagerie de l’inflammation ?
Shigufa Kahn Ali
Le rôle de l’ADN recombinase RAD52 dans le maintien de la stabilité du génome mitochondrial
François Valiquette
Le rôle de RAB21 dans le maintien de l’homéostasie intestinale.
Sonya Nassari
Le rôle et le mécanisme de l'ubiquitine ligase DDB1 / CUL4 dans la régulation des fonctions nucléolaires
Alyson McKenna
L’imagerie par résonance magnétique moléculaire révèle l’impact de l’inflammation neurovasculaire sur la formation de métastases cérébrales
Dina Sikpa
L’utilisation du microbiome intestinal pour la prédiction de lésions cancéreuses colorectales
Thierry Chénard
MODES D'INTERACTION NON CANONIQUES ENTRE LE RECEPTEUR TYROSINE KINASE (RTK) MET ET L'ISOFORME P66 DE LA PROTEINE SHC ET SA DUALITE DE FONCTION CELLULAIRE
Jesús GC Ojeda
Mutational signatures of alternative DNA repair pathways in human cancer cells
Samuel Zimmer
Oncolytic reovirus modulates host cell alternative splicing landscape during infection through the μ2 protein
Simon Boudreault
Pancreatic cancer cells require DNA-PK activity to support their growth
Rachita Chatterjee
plateforme d'histologie et de microscopie électronique
Anne Vézina
Plateforme du Centre d’imagerie moléculaire de Sherbrooke (CIMS)
Jacques Rousseau
Plateforme RNomique de l'Université de Sherbrooke
Mathieu Durand
Platforme de bio-informatique et phénotypique du Département de Biologie de l'Université de Sherbrooke
Jean-Francois Lucier
Portrait du devenir clinique des patients ayant subi une résection antérieure basse avec iléostomie temporaire de protection (ITP) et impact des complications liées aux ITP sur l’intégralité des protocoles de chimiothérapie adjuvante et la survie sans récidive.
N.Amhis
Quantification of hypoxia in human glioblastomas with PET imaging
Redha-alla Abdo
Régulation de la stabilité du génome par les E3 ubiquitine ligases PRP19 et RFWD3
Maïlyn Yates
Regulation of colorectal cancer cell differentiation through the Hippo pathway
Sepideh Fallah
Repurposing chloroquine as an anti-glioblastoma therapeutic.
Laurent-Olivier Roy
Rétrocontrôle de la signalisation Wnt/b-caténine par la tyrosine phosphatase Shp1 dans l’épithélium intestina
Caroline Leblanc
Rôle de la myotubularine Sbf, une protéine régulant l’autophagie, dans la différenciation des cellules intestinales.
Camille Lacarrière
Role of Krt15+ stem cells in esophageal squamous cell carcinoma
Julie Douchin
Snazarus et RAB21 des acteurs de l’autophagie aussi impliqués dans la biogenèse de gouttelettes lipidiques
Marie-France Bossanyi
SOCS-dependent regulation of hepatocarcinogenesis
Md Gulam Musawwir Khan
Split BioID : Développement de la complémentation de fragments de biotine ligases afin d’augmenter la résolution dans la détection d'interactions protéines-protéines
Gabrielle Tapp
Study of mutational signatures associated with replication stress in human cancer cells
Lisa Casimir
Surgical trauma induces postoperative natural killer cell dysfunction in colorectal cancer patients through the NKG2D-NKG2DL pathway
Orneala Bakos
Targeting metastatic Triple Negative Breast cancer with an immunogenic cancer cell vaccine
Seyedeh Niavarani
TBC1D25 et son implication dans la régulation négative de RAB21
Caroline Normandin
The development of personalized CAM Avatar model to predict chemotherapeutic drug sensitivity/resistance of gliomas.
Martine Charbonneau

Caractérisation de la réponse immunitaire au virus de la stomatite vésiculaire oncolytique dans le cancer de la vessie


Francis Bernier-Godon11, Seyedeh Niavarani11, Christine Lawson11, Patrick Richard1, Lee-Hwa Tai1,2
1U sherbrooke 2Université de Sherbrooke

Contexte et justification: Le cancer de la vessie est le cinquième cancer le plus fréquent au Canada et a une haute récurrence. Le traitement actuel, le Bacillus Calmette-Guérin est abandonné par 65% des patients, c'est pourquoi la recherche d'un traitement alternatif est importante.

Objectifs et hypothèses: Dans ce projet, nous évaluerons l'impact d'un virus de la stomatite vésiculeuse (VSVδ51) sur le Non Muscle Invasive Bladder Cancer (NMIBC). Nous émettons l'hypothèse que l'infection des cellules cancéreuses de la vessie avec VSVδ51 induira la mort cellulaire immunogène et que l'injection intravésicale de VSVδ51 dans des modèles de souris xénogéniques du cancer de la vessie activera une réponse immunitaire dirigée contre les tumeurs.

Matériel et méthodes: Nous utiliserons des lignées cellulaires de cancer de la vessie humaines (UMUC3 et 5637) pour des études in vitro et in vivo. Les cellules infectées et leurs surnageants sont récoltés pour déterminer la nature de la mort cellulaire induite par le virus. En parallèle, des tumeurs fraîches de NMIBC ainsi que des cellules mononucléées du sang périphérique seront obtenues après le consentement des patients NMIBC subissant une résection transurétrale. Le volume tumoral du modèle animal est pris par imageries aux ultrasons.

Résultats et conclusions: Nous avons observé la présence de trois marqueurs de mort cellulaire immunogénique : l'exposition de la calréticuline, la libération de HMGB1 et la libération d'ATP dans les lignées cellulaires du cancer de la vessie infectées par VSVδ51. Le surnageant mis en co-culture avec des cellules immunitaire a été en mesure d'induire la migration des cellules en plus de polariser les macrophages en type M1 capables de provoquer la prolifération chez les lymphocytes T. En résumé, ces résultats in vitro montrent que VSVδ51 induit la mort cellulaire immunogène.

Caractérisation dynamique de l'environnement protéique de RAB21 via APEX2


Tomas Del Olmo1
1Université de Sherbrooke

Le trafic membranaire constitue l’ensemble des voies de sécrétion, d’endocytose, et de dégradation lysosomales. La régulation de chacune de ses fonctions représente un enjeu majeur pour l’homéostasie cellulaire puisque des défauts du trafic membranaire sont impliqués dans de nombreuses pathologies telles que le cancer. L’ensemble des étapes du trafic membranaire, de la formation de vésicules aux évènements de fusion avec un compartiment cible, est donc finement régulé. L’un des principaux régulateurs de ce trafic est la famille des RABs. Au vu de leur rôle de chef d’orchestre du trafic membranaire et de l’importance de ce trafic dans le cancer, il a été mis en évidence que des défauts de fonctionnement des RABs sont directement impliqués dans des processus tumoraux. Par exemple, des mutations activatrices dans RAB35 ont été caractérisées comme oncogéniques. Il est donc important de comprendre le fonctionnement des RABs, et en particulier dans le contexte tumoral. Les RABs sont de petites GTPases qui cyclent entre leur forme active, liée au GTP et leur forme inactive, liée au GDP. Sous leur forme active, elles recrutent des effecteurs essentiels à la réalisation de leur fonction. Or, l’identification des partenaires protéiques des RABs, à ce jour, comporte de nombreux inconvénients. Nous nous sommes intéressés à RAB21, une RAB méconnue qui joue un rôle essentiel dans la régulation de l’autophagie. Les effecteurs de RAB21 impliqués dans cette régulation sont aussi méconnus. Nous avons, dans cette étude, réalisé des analyses protéomiques en condition de carence afin de caractériser les partenaires stimuli dépendants de RAB21. Pour ce faire, nous avons réalisé des expériences de marquage par proximité via l’approche APEX2, et ce, dans les cellules HeLa. Ainsi, nous avons pu identifier une interaction entre mTOR et RAB21 dépendante de la carence. Nous avons ensuite caractérisé le rôle de RAB21 sur la régulation de mTORC2. Lors de notre étude, nous sommes donc parvenus à identifier les variations de l’environnement protéique de RAB21, en condition de carence. Cette approche nous a permis de caractériser un nouveau rôle de RAB21 dans la régulation de l’activité de mTORC2. En tant que régulateur de mTOR, RAB21 apparait comme une nouvelle cible intéressante afin de moduler l’activité de cette dernière.

Clinical Outcomes of Patients (pts) with Human Epidermal Growth Factor Receptor 2(HER2) equivocal early breast cancer (EBC).


Alexandra Desnoyers1,2, Djamal Berbiche3, Fléchère Fortin4, Meriam Dami5, catherine prady6, Samuel Martel2,6, Giovanna Speranza2,6, Michel Pavic1,2, Sara Soldera2,6
1Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke, Hémato-oncologie, Sherbrooke, Canada, 2Université de Sherbrooke, Faculté de Médecine et des Sciences de la Santé, Sherbrooke, Canada 3Université de Sherbrooke, Sciences de la Santé Communautaire, Longueuil, Canada 4Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke, Génétique médicale, Sherbrooke, Canada 5CISSS Montérégie-Centre, Hôpital Charles-Lemoyne, Pathologie, Greenfield Park, Canada 6CISSS Montérégie-Centre, Hôpital Charles-Lemoyne, Hémato-oncologie, Greenfield Park, Canada

Goals: It is unclear whether pts with HER2 equivocal EBC determined by immunohistochemistry (IHC) and fluorescent in situ hybridization (FISH) as per the 2013 American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guidelines benefit from HER2-directed therapy as data are lacking in this population. In the 2018 update, these tumors are reclassified as HER2 negative in the absence of protein overexpression, but the impact of trastuzumab remains unknown.  

Methods: We conducted a multicenter retrospective study of all pts between 2013 and 2017 with HER2 equivocal EBC (FISH average HER2 copy number 4.0 but <6.0 signals per cell and HER2/CEP17 ratio <2.0) to describe their clinico-pathological characteristics, determine their prognosis and explore the impact of adjuvant trastuzumab. Descriptive statistics were used to summarize patient and disease features, disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) were estimated using Kaplan-Meier method and multivariable analysis was performed to examine potential prognostic variables. Outcomes according to the use of trastuzumab were compared using Cox proportional hazards regression. 

Results: Seventy-eight patients were included: median age was 65 years. The majority were postmenopausal (87%), had T1-2 tumors (90%), no nodal involvement (71%), hormone receptor positive disease (91%), intermediate (53%) or high grade (44%) and HER2 IHC negative (5%) or equivocal (95%) tumors. After a median follow up of 27 months, median DFS and OS were not reached, with a 2-year DFS and OS of 86.4% and 88.9%, respectively. Later stage disease and no use of endocrine therapy were associated with worse prognosis. Pts treated with adjuvant trastuzumab (18%, n= 14) presented longer DFS and OS, although not significant, compared to those who were not (DFS HR 0.59, 95% confidence interval (CI) 0.07-5.19 and OS HR 0.52, 0.057-4.71). 

Conclusion: Pts with HER2 equivocal EBC present with low risk clinico-pathological features, negative or equivocal HER2 IHC and favorable prognosis. Despite this, a trend towards benefit from adjuvant trastuzumab was noted and this finding should be further explored in larger data sets. 

Effet de l’entraînement mixte sur le profil inflammatoire chez le patient oncogériatrique débutant un traitement contre un cancer curable


Parent-Roberge H1,2, Fontvieille A1,2, Fulop T1,3, Pavic M3, Riesco E.1,2
1Centre de recherche sur le vieillissement, CSSS-IUGS 2Faculté des sciences de l’activité physique, Université de Sherbrooke 3Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke.

Introduction :  L’entraînement mixte (aérobie et renforcement musculaire) est actuellement recommandé en parallèle des traitements systémiques pour réduire la fatigue liée au cancer (FLC) et éviter le déclin de la condition physique chez la population oncogériatrique. Il a été suggéré que ces effets positifs puissent être médiés par une réduction de l’activité inflammatoire liée à la maladie et aux traitements, mais l’effet de l’entraînement sur le profil inflammatoire de patients oncogériatriques en cours de traitements systémiques est actuellement inconnu. Objectif : l'objectif principal est de vérifier l’impact d’un programme d’entraînement mixte progressif et supervisé de 12 semaines sur le profil inflammatoire de patients âgés débutant un traitement systémique à visée curative, et l'objectif secondaire est de vérifier l’association avec la FLC. Méthodologie : Il s’agit d’une analyse préliminaire issue du projet-pilote CANcer-EXercice (CANEX) actuellement en cours. Dix personnes âgées (65-80 ans) débutant un premier traitement systémique (chimiothérapie néoadjuvante et/ou hormonothérapie) ont été recrutées et randomisées dans l’un des deux groupes suivants : 1) entrainement mixte (ENT, n=5), 2) témoin (TEM, n=5). Groupe ENT : 3 séances d’entrainement mixte/semaine. Groupe TEM : 3 séances d’étirement/semaine. Les variables principales sont le profil inflammatoire (IL-1ra, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-15, Leptine, Adiponectine [spectrophotométrie]) et la FLC (questionnaire FACIT-F). Des variables secondaires (capacité physique, composition corporelle) et de contrôle (niveau d’activité physique, habitudes alimentaires) ont aussi été mesurées. L’ensemble des mesures ont été faites avant et après 12 semaines d’intervention. Résultats : Aucun changement significatif sur le profil inflammatoire et la FLC n’a été observé chez aucun groupe (tous p > 0,05). La taille de l’effet suggère une possible réduction de la FLC chez le groupe ENT (0,47) et une absence d’effet chez le groupe témoin (0,04). De plus, la masse maigre a augmenté chez le groupe ENT (p = 0,04). Discussion : l’entraînement mixte pourrait avoir un effet de réduction de la FLC et d’augmentation de la masse maigre, mais qui ne semblent pas médiés par l’activité inflammatoire.

Étude des voies alternatives de réparation de l'ADN médiées par la recombinase RAD52


Jean-Christophe Dubois1, Maïlyn Yates1, Alexandre Maréchal1
1Université de Sherbrooke

Les cellules sont exposées à des stress génotoxiques qui peuvent mener à des lésions dans l’ADN. Dans les cellules saines, la plupart de ces dommages sont pris en charge par des voies canoniques de réparation telles que la recombinaison homologue (HR) qui commettent très peu d’erreurs. Cependant, durant l’oncogenèse, certaines voies de réparation moins fidèles sont activées, ce qui accèlère la déstabilisation du génome des cellules cancéreuses. Plusieurs de ces voies alternatives sont médiées par la recombinase RAD52, une protéine qui n’est pas essentielle à la survie des cellules saines. Comme les voies de réparation canoniques sont fréquemment inactivées dans les tumeurs, certaines cellules cancéreuses sont dépendantes des voies alternatives de réparation de l’ADN pour survivre et proliférer. Par exemple, plusieurs types de cancers (sein, ovaires) HR-déficients (BRCA1-, BRCA2-,…) dépendent des voies alternatives pour réparer les lésions dans leur ADN. Ainsi, Il a été démontré que la déplétion de RAD52 dans les cellules HR-déficientes provoque une létalité synthétique. En plus des cancers HR-déficients, environ 15% des cancers utilisent la voie du « Alternative Lenghtening of Telomeres » (ALT) pour préserver leurs télomères au lieu de réactiver la télomérase. Certains groupes ont montré que cette voie partage plusieurs ressemblances avec les voies alternatives médiées par RAD52.

 

Ces voies alternatives de réparation de l’ADN sont contrôlées par la recombinase RAD52, mais le mode de recrutement de RAD52 aux lésions de l'ADN est très mal caractérisé dans les cellules humaines et les partenaires de RAD52 dans les voies alternatives ne sont pas bien connus. Nous présentons ici les résultats de nos travaux visant à élucider ces deux aspects de la biologie de RAD52. Nous démontrons que RAD52 est recruté aux fourches endommagées par le complexe de liaison à l’ADN simple-brin RPA. Des expériences de protéomique ont aussi permis d’identifier plusieurs interacteurs constitutifs et induits par le stress réplicatif de RAD52. Nos travaux permettront de mieux comprendre ces voies de réparation qui permettent aux cellules cancéreuses de survivre au stress réplicatif. Inhiber ces voies pourrait constituer une stratégie pour augmenter l’efficacité des traitements basés sur l’induction de stress réplicatif.

Étude du récepteur à la laminine 67LR dans les cellules adénocarcinomateuses de côlon


Gabriel Cloutier1, Taoufik Khalfaoui1, Jean-François Beaulieu1
1Université de Sherbrooke

Le récepteur à la laminine 67LR (67 kDa laminin receptor) est un récepteur membranaire pour la chaine β1 des laminines. Initialement, le récepteur 67LR est retrouvé sous forme de précurseur cytoplasmique de 37kDa nommé RPSA (ribosomal protein SA). Dans les cellules humaines, RPSA intervient dans la formation du complexe de polyribosome qui est essentielle à une traduction efficace des ARNm. Le mécanisme par lequel la protéine ribosomale produit un récepteur membranaire est cependant encore très mal compris. Plusieurs hypothèses indiquent qu’une homo ou hétérodimérisation des protéines RPSA non associées aux ribosomes serait impliquée. D'autre part, une surexpression de 67LR est corrélée avec l'agressivité de plusieurs cancers. Le projet de recherche vise d’une part à confirmer la surexpression membranaire de 67LR dans des cellules de cancer colorectal et par la suite identifier le ou les partenaires d’hétérodimérisation. Pour confirmer la présence du récepteur 67LR à la membrane dans la lignée cellulaire Caco-2/15, nous avons effectué une protocole d’extraction par fractionnement cellulaire puis une série de centrifugation jusqu’à 210,000xg, permettant ainsi la séparation entre les ribosomes (RPSA) et les membranes (67LR). Suite à un immunobuvardage de type western nous retrouvons une protéine immunoréactive correspondant à la forme de 67kDa du récepteur dans la fraction soluble alors qu’une partie de la forme de 37kDa est retrouvée dans la fraction insoluble, suggérant ainsi la précipitation et l’association de cette dernière avec les membranes. Ce résultat est confirmé par la solubilisation de la forme 37kDa suite à un traitement au détergent. Ces résultats suggèrent l’existence d’un dimère cytoplasmique de 67kDa précurseur à la formation du récepteur membranaire. À terme, des analyses en spectrophotométrie de masse de la fraction soluble contenant la forme de 67kDa permettront d’obtenir l’identité de son partenaire dimérique et ainsi mieux comprendre son mécanisme et son rôle dans la carcinogenèse colique. 

Étude rétrospective comparant l'issue à 10 ans chez les patients ayant subi une prostatectomie radicale par voie ouverte et laparoscopique


Marie-Michèle Beaudry1, Robert Sabbagh2, Michel Carmel2, Arold Martel2, Claudio Jeldres2, Nadia Ekindi3, Patrick O. Richard2, Sara Medina Kasasni1
1Étudiante en médecine, Université de Sherbrooke 2Service d'urologie, Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke 3Département de pathologie, Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke

Introduction : Le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquent chez les hommes au Canada. Depuis quelques années, la prostatectomie radicale par approche minimalement invasive est la plus fréquente, alors que l’approche ouverte était traditionnellement préconisée. L’objectif de cette étude est de comparer la prostatectomie radicale par voie ouverte (PRO) et la prostatectomie radicale par laparoscopie (PRL) en se basant sur leurs résultats oncologiques et fonctionnels.

 

Méthodes : Il s’agit d’une étude rétrospective de tous les patients qui ont bénéficié de  PRO ou de PRL entre le 1er janvier 2006 et le 31 mai 2017 au CIUSSSE- CHUS.

 

Résultats : Un total de 1116 prostatectomies ont été effectuées durant cette période, desquelles 465 étaient des PRO et 651 des PRL. Le temps chirurgical médian était significativement plus court pour la cohorte PRO comparativement à la cohorte PRL (130min [IQR:115-160] vs 160min [IQR:135-185]; p<0,001) alors que le temps médian d’hospitalisation était plus court pour la cohorte PRL (3 jours [IQR:2-3] vs 2 jours [IQR: 2-3]; p<0,001). Les pertes sanguines étaient moindres dans la cohorte PRL que dans la cohorte PRO (500mL [IQR: 350-700] vs.300mL [IQR: 200-500]; p<0,001). Après un suivi moyen de 98 mois, aucune différence significative ne fut observée dans les deux groupes par rapport à la survie globale, au taux de récidive biochimique et à la proportion de marges chirurgicales positives. Par contre, la présence de marges positives, un score de Gleason ≥ 7 (p<0,001) et un stade pathologique ≥pT3b (p<0,001) étaient tous des facteurs associés à un risque accru de récidive biochimique. La fonction sexuelle subjective à 1 an était similaire entre les 2 groupes (67,3% vs 65,0 %; p=0,2) alors qu’une différence subjective fut observée pour la continence urinaire; les hommes ayant eu une PRO nécessitaient moins souvent de protections à 1 an que les hommes ayant eu une approche par PRL (86,9% vs. 78,9%; p<0,001).

 

Conclusion : Nos résultats démontrent que les deux approches chirurgicales sont similaires en termes de résultats oncologiques et de préservation de la fonction sexuelle. Les patients ayant eu une PRO auraient un meilleur taux de continence urinaire subjectif à 1 an et un temps chirurgical plus court alors que les patients ayant eu une PRL démontreraient des pertes sanguines moins importantes et une durée d’hospitalisation plus courte. Les deux approches partageant des résultats similaires, l’approche chirurgicale devrait être choisie dans un modèle de décision partagée entre le médecin et son patient.

Formulation d’un puissant inhibiteur peptidique de l’enzyme PACE4, en vue d'une administration orale pour le traitement du cancer la prostate


Pauline Navals1,2, Anna Kwiatkowska1, Nawel Mekdad1, Frédéric Couture1, Sandra Gagnon1, Yves Dory2, Robert Day1
1Institut de pharmacologie de Sherbrooke (IPS) 2Faculté de sciences de Sherbrooke, département chimie

Notre laboratoire travaille maintenant depuis des années à la découverte et au développement de nouvelles thérapies nécessaires à la lutte contre le cancer de la prostate. Il a été démontré l’implication d’une enzyme faisant partie de la famille des proprotéines convertases, la PACE4. Spécifique et nécessaire à la progression tumorale et ce dans tous les stades de la maladie (localisé, avancé et métastatique), la PACE4 s’avère être une cible de premier choix. A la suite de longues et rigoureuses études de chimie combinatoire et de structure-activité (SAR), un inhibiteur peptidomimétique puissant et efficace a été développé, c’est le composé C23 (séquence: Ac-DLLLLRVK-Amba). Il démontre une forte inhibition envers la PACE4 et une excellente activité antiproliférative in vitrosur différents types de modèles cellulaires. Cependant comme tout peptides médicaments il se heurte à des limites qui leurs sont inhérents. Une dégradation facile et rapide, une solubilité relative et donc une administration difficile. Pourtant, une infime proportion de C23 est capable d’agir et d’engendrer une régression tumorale in vivo efficace et significative. Le composé est en passe de rentrer en études précliniques mais son administration doit être facilité et sa dégradation réduite. Dans ce but, notre laboratoire a opté pour la mise en place de techniques de formulations et ce par l’utilisation de polysaccharides macrocycliques particuliers, les cyclodextrines. Ces sucres possèdent un caractère amphiphile qui les rend soluble en milieu aqueux et permet la formation de complexes « hôte-invité » avec une variété de molécules. De plus, ils sont connus pour être stable face aux dégradations du tube digestif et permettent un passage membranaire facilité. Notre inhibiteur C23 étant également amphiphile, le choix d’une inclusion entre le peptide et la cavité interne de la β−cyclodextrine a été fait. Six analogues au C23 ont été synthétisés afin de rendre la formation de tels édifices possibles. La RMN 2D NOESY ainsi que la spectrométrie infra-rouge (FTIR) ont été choisies afin de vérifier la formation des complexes. Ces analyses ont permis de mettre en évidence les succès de complexation sur tous les analogues synthétisés. Tous (complexés ou non) ont ensuite été testés in vitroafin de valider la préservation de leurs propriétés inhibitrices. De plus, tous les composés ont démontré une certaine activité antiproliférative lors d’essais de prolifération cellulaire à la suite desquels un inhibiteur tête de série a été identifié. Des essais de stabilité plasmatique, en fluide gastrique et intestinal ont alors été réalisés et ont permis de mettre en évidence un gain significatif de stabilité. Ces résultats plus qu’encourageants nous ont mené à envisager des premiers tests in vivo dans le but de déterminer le profil pharmacocinétique complet de notre tête de série via deux types d’administration, orale et intraveineuse.

Gliotrap: un nouveau traitement contre les tumeurs cérébrales primaires


Laurence Déry1, Gabriel Charest1, Brigitte Guérin1, david fortin1
1Université de Sherbrooke

Le Glioblastome est l’une des tumeurs cérébrales les plus agressives avec une survie médiane de 14 à 16 mois et où moins de 5% des patients survivent plus de 5 ans. Le traitement actuel consiste en une résection maximale de la tumeur suivie d’une combinaison de chimiothérapie et de radiothérapie. Ce traitement n’offre malheureusement pas des résultats très significatifs avec un temps de survie sans progression de 6,4 mois (Progression-Free Survival-PFS). Plusieurs facteurs expliquent ce mauvais pronostic :

  1. La nature infiltrative de la maladie empêche la résection complète de la tumeur lors de la chirurgie et tenter d’enlever toutes les cellules tumorales disséminées pourrait mener à des dommages neurologiques importants pour les patients.
  2. Certaines cellules tumorales sont en fait des cellules souches tumorales; ces cellules sont extrêmement difficiles à éliminer car elles possèdent une très grande capacité de migration et de résistance aux agents chimiothérapeutiques, ainsi qu’à la radiothérapie.
  3. La barrière hémato-encéphalique bloque complètement ou partiellement le passage de certains agents chimiothérapeutiques et les doses de radiothérapie sont limitées par leur effet toxique.

Il a été observé que lors de récidives du cancer, les cellules tumorales sont la plupart du temps situées en périphérie de la cavité tumorale. De ce fait, afin d’être en mesure d’éliminer ces cellules et d’augmenter l’efficacité du traitement, une nouvelle approche a été conceptualisée, et est développée dans notre laboratoire. Cette méthode consiste en l’élaboration d’un hydrogel contenant des molécules permettant d’attirer les cellules cancéreuses ainsi que des agents chimiothérapeutiques et radiothérapeutiques pour les éliminer.

La première partie de ce projet consiste à tester in vitro l’attraction des cellules de glioblastomes de rat (F98) et d’humain (U-87 MG) par les molécules chimio-attractives CXCL10 (CXCR3), CCL2 (CCR2) et CCL11 (CCR3). Par conséquent, il sera donc possible d’observer un déplacement physique des cellules gliales néoplasiques vers l’endroit où se situe les ligands alors que ce déplacement ne devrait pas se produire avec les échantillons contrôle ne contenant pas de chimioattractants. La suite des manipulations sera accomplie in vivo avec des rats Fischer F98 afin de démontrer le principe de migration des cellules tumorales préalablement expliqué in vitro.

Identification de Nouvelles E3 Ubiquitine Ligases Impliquées dans la Protection du Génome Humain


Billel Djerir1, Théo Morin1, Alexandre Maréchal1
1Département de biologie, Université de Sherbrooke

Les cellules eucaryotes continuellement exposées à des sources endogènes et exogènes de dommages à l'ADN menacant leur intégrité génomique. Néanmoins, les cellules résistent à ces perturbations en actionnant un réseau complexe de protéines qui détectent, signalent et réparent les lésions qu’on appelle la réponse aux dommages à l’ADN (DDR). La coordination des différents facteurs recrutés aux sites de dommages est coordonnée par des modifications post-traductionnelles. L’ubiquitination est une modification chimique réversible qui consiste en l’ajout covalent d’une ou de plusieurs protéines d’ubiquitine sur un ou plusieurs résidus lysines d’un substrat protéique. Cette modification régule le niveau et l’activité des protéines et est sous le contrôle de plus de 600 E3 Ligases dans les cellules humaines pouvant toutes ubiquitiner un lot de substrats spécifiques. Ainsi, plusieurs E3 Ubiquitine Ligases modulent des facteurs de maintenance du génome pour contrôler leur niveau, leur recrutement et leur activité au niveau des lésions génomiques. Parmi toutes ces E3, seulement une poignée ont un rôle démontré dans la DDR alors qu’on en dénombre plus de 180 annotées avec une localisation nucléaire. Dans le cadre de cette étude, un criblage systématique des E3 Ubiquitine Ligases nucléaires humaines a été effectué afin d’identifier celles impliquées dans le maintien de la stabilité du génome. Par une approche bio-informatique, nous avons élaboré une librairie lentivirale de 137 E3 Ubiquitines Ligases nucléaires non caractérisées dans la DDR, fusionnées à un épitope FLAG/3xHA. Nous avons examiné leur recrutement aux sites de bris dans l’ADN induits par micro-irradiation au laser 405 nm. Afin de caractériser le rôle de ces nouvelles E3 Ubiquitine Ligases recrutées aux sites de lésions d’ADN, une librairie d’ARN interférents (siRNAs) sera utilisée pour réaliser des essais de viabilité cellulaire en présence d’agents génotoxiques dans des cellules déplétées de ces candidats. Nos travaux permettront d’identifier de nouveaux facteurs importants pour la réparation de l’ADN et mèneront à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires responsables de la stabilité du génome.

Identification of proteins regulated by SOCS1 through Mass Spectrometry using Stable Isotopic Labelling of Amino acids in Cell culture (SILAC)


Madanraj Appiya Santharam1, François-Michel Boisvert1, Subburaj Ilangumaran1
1Université de Sherbrooke

 

Suppressor of Cytokine Signaling 1 (SOCS1), which regulates cytokine and growth factor signaling, functions as a tumor suppressor in several cancers. At least part of the tumor suppressor function of SOCS1 is attributed to its role as a substrate adaptor in the E3 ubiquitin ligase complex called CRLSOCS1, resulting in the ubiquitination and proteasomal degradation of the substrate proteins. More than 20 signaling proteins are known to be targeted by SOCS1 for proteasomal degradation. The significance of SOCS1-mediated protein ubiquitination and degradation is not yet clear. We undertook a mass spectrometry (MS)-based study to systematically identify cellular proteins regulated by SOCS1 using the Stable Isotopic Labelling of Amino acids in Cell culture (SILAC) method. 

 

The murine hepatocellular carcinoma (HCC) cell line Hepa 1-6 (Hepa), transduced with pWPT lentiviral vector containing wildtype SOCS1 (HS cells) or SOCS1 with R105K mutation within the SH2 domain (HR cells) or the empty vector (HV cells) were grown in SILAC media, containing different isotopes of Arginine and Lysine, namely light (R0K0), medium (R6K4) and heavy (R10K8), for 5 generations. Triplicate cultures of each cell type were stimulated with mouse HGF for 24h, with its respective control set of triplicates at steady state. The cells were harvested, lysed, proteins separated on SDS-PAGE gels and peptides extracted by in-gel trypsinization. Eluted peptides were loaded into the MS and the proteins identified from the raw files were quantified using Maxquant software. To identify the proteins that are significantly modulated by SOCS1, the fold change in protein expression was plotted against the log10p-value, which was calculated for each protein by unpaired T-test using R software.

 

Results: A total of 3440 proteins were found to be differentially expressed in the presence of SOCS1 at steady state, of which 181 proteins were significantly modulated (p <0.05) and at least by 2-fold (50% or 200% of control). Surprisingly, this group did not include any protein known to be downregulated by SOCS1. The pathways enriched by these proteins were determined using the STRING database. Curiously, different proteins within certain biological pathways, particularly the ubiquitin and the proteasome pathways, are differentially regulated by SOCS1: while some proteins are downregulated, certain others are upregulated. Specifically, SOCS1 was found to upregulate the immunoproteasome component PSMB8 both at steady state that was reversed by HGF stimulation. Further analysis is required to determine the implications of differential regulation of the ubiquitin/proteasome pathway by SOCS1.

Imagerie de perfusion et de perméabilité cérébrale pour le suivi clinique de métastases cérébrales


Benoît Bourassa-Moreau1, Laurent Gagné-Brosseau2, Réjean Lebel1, David Mathieu3, Martin Lepage1
1Centre d’imagerie moléculaire de Sherbrooke, Département de médecine nucléaire et radiobiologie, Université de Sherbrooke, 3001 12e Avenue Nord, Sherbrooke, Québec, Canada. 2Département de radiologie diagnostique, Université de Sherbrooke, 3001 12e Avenue Nord, Sherbrooke, Québec, Canada. 3Service de neurochirurgie, Département de chirurgie, Université de Sherbrooke, 3001 12e Avenue Nord, Sherbrooke, Québec, Canada.

    La radiochirurgie stéréotaxique est maintenant la modalité de choix pour le traitement des métastases cérébrales. La méthode actuellement recommandée pour le suivi radiologique post-traitement se base principalement sur la variation de la taille des lésions entre des examens périodiques en imagerie par résonance magnétique (IRM) conventionnelle. Cependant, jusqu’à 30% des patients présentent une pseudo-progression, c’est-à-dire une progression en taille des lésions due aux effets aigus du traitement qui présente un aspect similaire à la récidive tumorale aux images de suivi. La différenciation entre la récidive tumorale et la pseudo-progression est essentielle afin d’éviter des traitements inutiles pour les patients, et nécessite plusieurs examens périodiques ce qui peut engendrer des délais dans l’ajustement du traitement.

 

    Ce travail vise à comparer les performances de trois méthodes d’imagerie basées sur la dynamique de l’injection intraveineuse de traceurs pour différencier la récidive tumorale de la pseudo-progression. Le Gadobutrol, un agent extracellulaire qui ne traverse pas la barrière hémato-encéphalique saine, est injecté en IRM dynamique rehaussé par agent de contraste (dynamic contrast-enhanced - DCE) et dynamique par contraste de susceptibilité (dynamic susceptibility contrast - DSC). Le fluoro-éthyl-tyrosine (FET), un marqueur de l’internalisation de la tyrosine, est injecté pour l’imagerie par tomographie à émission de positrons (TEP). La littérature rapporte une variation de l’accumulation dynamique de ces traceurs pour la récidive tumorale qui est attribuable à une augmentation de la perfusion, de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, du volume sanguin et, pour le FET, de la captation cellulaire. Des modèles pharmacocinétiques nous permettent d’estimer ces paramètres physiologiques à partir du signal dynamique mesurés par IRM et TEP. Nous présenterons ces méthodes ainsi que les cartes de paramètres pharmacocinétiques des premiers patients de l’étude.

 

    Ultimement, ce projet permettra de déterminer quelle méthode est la plus performante pour différencier la récidive tumorale de pseudo-progression et si la combinaison de ces méthodes peut améliorer la précision diagnostique.

Implication de la voie Hedgehog dans la résistance à l'anoïkose de cellules cancéreuses coliques


Blanche Senicourt1, jean-francois.beaulieu@usherbr 1
1Université de Sherbrooke

La voie Hedgehog (HH) est impliquée dans de nombreux cancers et joue un rôle majeur dans le maintien des cellules souches cancéreuses. La voie canonique implique la liaison du récepteur PTCH1 à son ligand, entraînant la translocation de SMO à la membrane et l'activation subséquente des facteurs de transcription GLI. Cependant, le rôle joué par la voie HH dans le cancer demeure controversé. Nos précédentes investigations dans des lignées cancéreuses coliques ont montré que la voie était activée dans certaines de ces lignées, en lien avec la présence d'un cilium primaire. Dans le but de caractériser le rôle de cette voie, nous avons étudié les lignées cancéreuses coliques isogéniques SW480 (non invasives, non métastatiques) et SW620 (invasives, métastatiques) du point de vue de la résistance à l'anoïkose, une caractéristique qui accompagne la progression métastatique. L'activité de la voie HH a été mesurée sur la base de l'expression de l'effecteur final GLI1 ainsi que du récepteur PTCH au niveau des messagers (qPCR), ainsi que l'expression des ligands et des composants de la voie HH. Un inhibiteur de GLI (GANT-61) a été utilisé pour étudier l'impact de l'activité HH sur l'anoïkose, et cette caractéristique a été approchée par des mesures de l'activité de la caspase 3 dans des cultures sans ancrage. Nos résultats montrent que la voie HH joue un rôle dans la résistance à l'anoïkose des cellules SW480 et SW620. En effet, l’activité caspasique apparaît augmentée dans les cellules cultivées sans ancrage et traitées par l’inhibiteur GANT-61. Cette étude supporte l'idée que la voie HH joue un rôle majeur dans la progression métastatique du cancer colorectal.

 

(Supporté par les IRSC)

In-vitro cytotoxic effect of 64Cu/NOTA-terpyridine platinum complex, as a novel chemoradiation therapy (CRT) agent


Meysam Khosravifarsani1, Samia Ait-Mohand1, Léon Sanche1, Brigitte Guérin1
1Université de Sherbrooke, Faculté de Médecine et des Sciences de la Santé, Sherbrooke, Canada

Introduction: Chemoradiation therapy (CRT) is a standard treatment for most of inoperable and metastatic cancers. Recent advances in the field of chemotherapy have developed several metal-based compounds for treatment of cancers, but normal tissue reactions limit the ability of giving additional dose of chemotherapeutic agents. Thus, there is a considerable enthusiasm to improve the efficacy of chemoradiation therapy regime through synthesizing new metal-based compounds with lower toxicity for normal tissues. Here, we have synthesized 64Cu-NOTA terpyridine platinum complex as a novel bi-metallic agent that is tailored toward quadruplex motifs on DNA with the hope that such complex could give rise to greater selectivity

Methods: The in-vitro cytotoxic effect, cell uptake, internalization and efflux of 64Cu-NOTA terpyridine platinum complex and other control compounds were tested on a colorectal cancer cell (HCT116) as well as a normal fibroblast cell line (GM05757) at 24, 48 and 72 hours after initial incubation time.

Results: natCu-labeled NOTA-terpyridine platinum complex showed 3.35, 1.74 and 2.26 times higher cytotoxicity against HCT116 cells as compared to GM05757 normal cells. However, the cytotoxic effects of our complex (IC50 = 298.2 – 481 µM) was much less than cisplatin (IC50 = 23.3 – 41.6 µM). Remarkably, removal of natCu  from our complex (NOTA-terpyridine platinum) increased its activity against HCT116 cells from 7.63 (IC50=63±1.08µM) to 13.53 (IC50=24±1.25µM) folds, suggesting considerable influence of charge on cytotoxicity of the complex. The internalization of 64Cu-NOTA terpyridine platinum complex in HCT116 cells increased from 15 min (0.04±0.021%) to 24h (18.7±2.77%) and reached a plateau at 48h (18.6±1.45%), post-administration. The percentages of internalization were significantly higher in HCT116 cancer cells as compared to GM05757 normal cells at 24h, 48h and 72h post-administration (Pvalue< 0.001), consistent with our data indicating higher cytotoxicity of the complex toward HCT116 cells. More importantly, the efflux profile of HCT116 cells showed that considerable amount of 64Cu-NOTA terpyridine platinum complex was retained throughout the time course from 15 min (100 ± 7.2 %) to 72h (48.13 ± 5.6%). Additionally, there was a little percentage of the complex (<1%) internalized in cold temperature (4°C) at all time points, indicating that passive uptake of the compound is not primarily responsible for internalization. Supplementary studies considering antagonism, synergism or additive effects of combined 64Cu with NOTA-terpyridine platinum complex, using the Combination Index (CI) method, is ongoing.

Conclusion: In conclusion, this work supports the potential use of 64Cu-labeled terpyridine platinum conjugate as a novel theranostic agent to diagnose and treat cancers.

La L-PGDS et ses peptides dérivés, des GEFs de la GTPase Rab4?


Samuel Picard1, Chantal Binda1, Samuel Génier1, Danny Létourneau1, Pierre Lavigne1, Éric Marsault1, Jean-Luc Parent1
1Université de Sherbrooke

    Nos derniers travaux ont permis d’identifier la L-PGDS (Prostaglandine D Synthase de type L) comme étant une GEF potentielle (GTP-exchange factor) de la petite GTPase Rab4. Tout en ayant une structure et un fonctionnement homologue à la plupart des GTPases de sa superfamille, Rab4 est principalement connue pour son rôle dans le recyclage vers la membrane plasmique de divers récepteurs et protéines. C’est cette même fonction qui permet à Rab4 d’accroître le potentiel métastatique de divers cancers, via une digestion des matrices extracellulaires causée par le recyclage incessant de récepteurs de facteurs de croissance et de métalloprotéases à la membrane plasmique. Une meilleure connaissance des déterminants de la liaison de Rab4 à sa GEF serait un atout majeur pour le développement éventuel d’un inhibiteur.

    Plusieurs peptides mimant la surface d’interaction LPGDS - Rab4 ont été synthétisés. Des tests in vitro de GTP-loading ont été effectués afin d’évaluer la capacité des peptides à catalyser l’échange GDP-GTP, inhérente au bon fonctionnement de la GTPase. L’un de ces peptides dérivés de la séquence de L-PGDS s’est avéré avoir des propriétés d’échange semblables à L-PGDS entière. À la lumière de ces résultats, la synthèse de divers dérivés peptidiques découlant de cette séquence a été réalisée.

    Une méthode robuste de quantification de l’échange nucléotidique est essentielle à la détermination des propriétés d’échange de ces peptides. Les méthodes les plus utilisées dans ce domaine ont recourt à des analogues nucléotidiques radiomarqués ou fluorescents. Bien qu’efficaces, ces méthodes sont couteuses et mal adaptées au criblage de nombreuses molécules. C’est pourquoi nous nous sommes tournés vers la RMN de protéine en solution. En plus de permettre l’identification des acides aminés de Rab4 impliqués dans (ou du moins influencés par) l’échange nucléotidique, la RMN nous permet de performer des expériences de cinétique de chargement en GTP en monitorant le déplacement chimique de ces résidus dans le temps.

    Un autre volet récent du projet porte sur la mesure de la fluorescence intrinsèque de Rab4. Cette fluorescence peut être attribuée aux résidus tryptophanes de la protéine. Ceux-ci subissent un changement conformationnel dépendant de la présence de GTP ou de GDP dans la pochette de liaison de Rab4. Ce même changement conformationnel résulte en une modification de l’intensité de fluorescence émise, nous permettant ainsi de monitorer in vitro l’état de chargement de la protéine à travers le temps. Ces résultats sont préliminaires mais toutefois prometteurs si validés avec les techniques couramment acceptées dans la littérature, vu le faible coût et la possibilité de criblage à haut débit. 

    En somme, la caractérisation moléculaire de l’échange GDP/GTP de Rab4 ainsi que la mise en place d’un essai robuste permettant de le monitorer sont les premiers pas vers le design rationnel d’inhibiteurs de Rab4.

Le 68Ga-4HMSA, un traceur TEP pour l’imagerie de l’inflammation ?


Samia Ait-Mohand1, Véronique Dumulon-Perreault3, Mélanie Archambault1, Brigitte Guérin2,3, Shigufa Kahn Ali1
1Université de Sherbrooke 2Université de Sherbrooke 3Centre d'imagerie moléculaire de Sherbrooke, CRCHUS

Introduction :  De nombreuses études réalisées sur l’inflammation démontrent qu’elle serait la cause possible de plusieurs maladies, dont certains types de cancers. Présentement, le 67Ga-citrate est le traceur par excellence utilisé de routine en médecine nucléaire pour l'imagerie de l'inflammation et des infections. Le 67Ga-citrate possède plusieurs désavantages reliés à sa longue demi-vie (T1/2 = 3,3 jours). Bien que le remplacement du 67Ga par le 68Ga (T1/2 = 68 min) a résulté en un traceur offrant une meilleure résolution spatiale, le 68Ga-citrate capte beaucoup au niveau des membres supérieurs offrant un très faible contraste dans cette région pour l’imagerie TEP (tomographie par émission par positron). Notre équipe a développé un chélateur qui possède 4 bras N-hydroxy-N-méthyl succinamide (4HMSA) et une très haute affinité pour le galium et stabilité in vivo.

 

Objectifs : L’objectif est de prouver que le 68Ga-4HMSA est aussi efficace que 68Ga-Citrate pour limagerie de linflammation tout en ayant un profil pharmacocinétique plus favorable.

 

Méthodes : Des souris Balb/c ont été injectées de façon intraplantaire avec 0,5mg/mL d’adjuvant de Freund complet (CFA). L’inflammation a été suivie à différents temps, soit 24h, 48h, 72h et 7 jours. Des scans TEP ont été acquis en mode dynamique à la suite de l’injection du produit (68Ga-4HMSA ou 68Ga-Citrate). Une biodistribution, 60 minutes post-injection a permis d’avoir le pourcentage de dose injecté par gramme de tissu.

 

Résultats/Discussion : Le 68Ga-citrate est reconnu comme un traceur non spécifique de l’inflammation (Petrik et al., 2014) et nos résultats concordent avec ceux de la littérature. En effet, nous avons observé que l’accumulation du 68Ga-citrate dans les organes reste relativement le même à différents temps d’inflammation. Par contraste, à 48h post-inflammation, le 68Ga-4HMSA s’accumule plus dans le sang, le plasma, les reins et au site d’inflammation, ce qui laisse sous-entendre que la captation du traceur serait modulée en fonction de la réponse inflammatoire.

 

Conclusion : Pour conclure, les résultats ont démontré que le 68Ga-4HMSA offre un meilleur profil de biodistribution et de dose, comparé au 68Ga-citrate, ce qui en fait un traceur intéressant pour l’imagerie TEP de l’inflammation. Les projets futurs viseront à mieux comprendre le mécanisme d’action du 68Ga-4HMSA.

Le rôle de l’ADN recombinase RAD52 dans le maintien de la stabilité du génome mitochondrial


François Valiquette1
1Université de Sherbrooke

Les mitochondries sont des organelles endosymbiotiques essentielles au bon fonctionnement des cellules eucaryotes qui possèdent leur propre ADN (mtADN), bien que la majeure partie du génome mitochondrial ait été transférée au génome nucléaire. Maintenir la stabilité de ce génome est essentielle à la prolifération et à la viabilité cellulaire comme en témoignent les nombreuses pathologies liés aux mutations du mtADN. Des recherches récentes ont démontré que les mitochondries humaines ont adopté plusieurs gardiens du génome nucléaire pour la réplication et la réparation de leur génome. Malgré cela, la compréhension des mécanismes moléculaires responsables de la protection du génome mitochondrial demeure limitée. Des résultats de notre laboratoire ont montré une interaction de la recombinase RAD52 humaine non seulement avec plusieurs protéines de réparation de l’ADN nucléaire mais également avec la protéine de liaison à l’ADN simple-brin SSBP1 et l’hélicase TWINKLE, des protéines essentielles pour la réplication et la réparation du génome mitochondrial. Par fractionnement biochimique des mitochondries, on observe également la localisation mitochondriale d’une partie du RAD52 cellulaire. Ces données préliminaires nous poussent à croire que RAD52 pourrait participer au maintien de la stabilité du génome mitochondrial chez les cellules humaines. Par conséquent, ce projet permettra de caractériser un rôle encore inconnu de RAD52 et ainsi améliorer notre compréhension des mécanismes de maintien de la stabilité du génome mitochondrial. Nos investigations pourraient mener à l’élaboration de nouvelles stratégies permettant de sensibiliser l’ADN mitochondrial à des agents génotoxiques ciblés. Dans le but éventuel de soutenir le développement de traitements de certains types de cancers qui résistent aux traitement de chimiothérapie classiques et dépendent fortement de leurs mitochondries pour proliférer.

Le rôle de RAB21 dans le maintien de l’homéostasie intestinale.


Sonya Nassari1, Steve Jean1
1Université de Sherbrooke

Au Canada, le cancer colorectal (CCR) est l’un des cancers les plus fréquents. En dépits de grandes avancées pour traiter cette pathologie, le CCR reste l’un des cancers les plus meurtriers au monde. Cette pathologie complexe est définie comme multifactorielle, et est associée à divers facteurs à risques. Parmi les différents acteurs impliqués, l’autophagie a été identifié comme un intervenant clé. L'autophagie est un mécanisme cellulaire induit par un stress, qui caractérise la dégradation et le recyclage de matériel cytosolique au lysosome. Divers défauts d'autophagie ont été identifiés chez des patients souffrant de CCR, néanmoins le rôle précis de l’autophagie dans le CCR reste flou. Afin de mieux caractériser l’implication de l’autophagie dans le CCR, nous nous sommes intéressés à définir le rôle de l’autophagie dans l’homéostasie du tissu intestinal ; et ce en caractérisant le rôle de RAB21, une petite GTPase, définit comme un régulateur de l’autophagie.

Pour mener cette étude nous avons utilisé la Drosophile, qui représente un outil génétique puissant et un excellent modèle pour l’étude de la biologie intestinale. En effet l’intestin de Drosophile présente une segmentation, une composition et un fonctionnement similaire à celui des mammifères.

Nous avons montré que la perte de Rab21 dans les entérocytes, médiée par des ARNis ou une forme dominante négative, favorise la formation d’un épithélium intestinale de type hyperplasique. En effet, dans un contexte de déplétion de RAB21, la morphologie du tissu intestinal est lourdement atrophiée, notamment de par l’accumulation de cellules formant des structures similaires aux polypes. De plus, l’homéostasie intestinale se voit dérégulée, avec notamment une augmentation des populations de cellules souches et entéro-endocrines. Enfin la perte de Rab21 dans les entérocytes conduit à une augmentation de la prolifération des cellules souches et de la mort cellulaire des entérocytes, ainsi qu’à une production importante de la cytokine UPD3. L’ensemble de ces résultats caractérisent un état précancéreux et démontrent donc un rôle important de Rab21 dans la prévention de l’initiation du mécanisme de carcinogénèse.

Ces résultats mettent en évidence un rôle inattendu de l'autophagie dans les entérocytes, et pourraient contribuer à long terme au développement de traitements préventifs chez des individus à risques pour le CCR.

Le rôle et le mécanisme de l'ubiquitine ligase DDB1 / CUL4 dans la régulation des fonctions nucléolaires


Alyson McKenna1, Marie-Line Dubois1, Dominique Lévesque1, François-Michel Boisvert1
1Département d’Anatomie et Biologie Cellulaire, Faculté de médecine et sciences de la Santé, Université de Sherbrooke

Les changements dans le contrôle du cycle cellulaire est un aspect fondamental du cancer et implique des modifications post-traductionnelles telles que l'ubiquitylation. La dérégulation de cette modification entraîne une prolifération incontrôlée et l’instabilité génomique. L’ajout de l'ubiquitine à ses protéines cibles implique une séquence de trois réactions médiées par les enzymes d’activation E1, de conjugaison E2 et de ligation E3, la dernière déterminant la spécificité du substrat. Les CRL (ubiquitine ligases Cullin – RING E3) attirent particulièrement l’attention. Elles constituent la plus grande famille d’ubiquitine ligases E3 et sont responsables de 40% de l’ubiquitylation cellulaire totale. Les CRL s'assemblent en complexes fonctionnels à l'aide d'un répertoire de récepteurs de substrat avec les Cullin et les protéines RING-box. La découverte de médicaments ciblant les CRL gagne en importance en raison de la multiplication de preuves indiquant le rôle important de ces enzymes en particulier dans le cancer, où les CRL et leurs substrats jouent souvent un rôle suppresseur de tumeur ou oncogène. L'un de ces complexes, le CRL4, est composé de Cul4A ou de Cul4B et s'assemble avec la protéine DDB1. La spécificité des différentes protéines cibles du complexe CRL4 provient d’une famille de protéines adaptatrices responsables de la reconnaissance des cibles, appelée DCAF (facteurs associés à DDB1/CUL4). Plus de 60 DCAF présumés ont été proposés pour l'ubiquitine ligase CRL4 sur la base d'homologie de séquence et de similarités de structure, mais les cibles protéiques de plus de 50% d'entre elles n'ont pas encore été identifiées.

Nous avons cloné et caractérisé ces 60 DCAF différentes en ce qui concerne leur localisation cellulaire (microscopie par immunofluorescence), leurs interactions protéine-protéine (purification par affinité couplé à la spectrométrie de masse) et leurs cibles de dégradation (en utilisant une approche de protéomique quantitative, le Pulse SILAC). Cette étude, qui nous a permis d’élucider de nouvelles fonctions pour le complexe CLR4, a également mis en évidence la localisation nucléolaire d’un sous-groupe de DCAF, ainsi que des cibles d’ubiquitylation identifiées en tant que protéines nucléolaires connues. Ces résultats mettent en perspective une nouvelle fonction du complexe CRL4 en association avec cette structure subcellulaire.

À long terme, l’identification des cibles, ainsi que des protéines impliqués directement dans la reconnaissance de ces protéines cibles, permettront de développer des inhibiteursspécifiques pour le complexe DDB1/CUL4 et certaines de ses fonctions spécifiques afin de sensibiliser les cellules cancéreuses aux agents endommageant l'ADN ou de cibler la régulation du cycle cellulaire. 

L’imagerie par résonance magnétique moléculaire révèle l’impact de l’inflammation neurovasculaire sur la formation de métastases cérébrales


Dina Sikpa1, Lisa Whittingstall1, Jérémie Fouquet1, Luc Tremblay2, Réjean Lebel1, Benoit Paquette1,3, Martin Lepage1,2
1Université de Sherbrooke 2CIMS 3Centre de recherche en radiothérapie

Introduction: Le développement d’un cancer est étroitement lié à la présence d’un microenvironnement inflammatoire. Alors qu’une inflammation intra-tumorale peut participer à la progression cancéreuse et mener à la dissémination de cellules tumorales circulantes (CTCs), la présence d’une inflammation à un site secondaire peut contribuer à l’adhésion des CTCs à l’endothélium vasculaire et initier la formation de métastases. Les protéines d’adhésion cellulaire exprimées par les cellules endothéliales sont essentielles à l’interaction entre cellules cancéreuses et hôtes. La protéine d’adhésion cellulaire vasculaire -1 (VCAM-1) est impliquée dans la migration transendothéliale des cellules cancéreuses dans plusieurs organes. Cependant, ce processus est méconnu dans le cerveau. Nous avons donc étudié le rôle de VCAM-1 dans l’entrée des cellules cancéreuses dans le cerveau.

 

Méthodes: Une inflammation locale a été générée chez des souris Balb/c par injection stéréotaxique de lipopolysaccharide (LPS, 1 µg) dans l’hémisphère droit. La distribution de VCAM-1 a été visualisée et semi-quantifiée 24 h après l’injection de LPS par imagerie par résonance magnétique (IRM) moléculaire, avec des microparticules d’oxyde de fer (MPOF) conjuguées à des anticorps ciblant VCAM-1 (MPOF-VCAM-1). VCAM-1 étant surexprimée par les vaisseaux des métastases, celles-ci peuvent être détectées avec les MPOF-VCAM-1. Pour étudier l'effet de l’inflammation sur l'entrée des cellules tumorales dans le cerveau, des souris ont été injectées avec du LPS (ou une solution de saline) 24 h avant l'injection intracardiaque de cellules de cancer du sein 4T1 (105 cellules dans 100 µL de PBS). L'imagerie des métastases a été réalisée 18 jours après l'injection de cellules cancéreuses. Pour évaluer si le blocage de VCAM-1 affecterait l'entrée des cellules, un groupe supplémentaire de souris ayant reçu une injection de LPS a aussi reçu une injection intraveineuse de MPOF-VCAM-1 4 h avant l'injection des cellules 4T1. Dans ce groupe, l'IRM a été réalisée 3 h après l'injection de MPOF-VCAM-1 (imagerie VCAM-1) et à J18 post injection des cellules tumorales (imagerie de métastases). Après la dernière séance d’imagerie, les cerveaux ont été prélevés pour analyse histologique.

 

Résultats: Les données d’IRM et d’histologie montrent que le fardeau métastatique augmente significativement dans le groupe injecté avec du LPS comparé aux conditions contrôles. Le blocage de VCAM-1 réduit le nombre de métastases à des valeurs contrôles. Ceci indique que 1) une inflammation neurovasculaire augmente l’incidence des métastases cérébrales (MC) et 2) le blocage de VCAM-1 réduit cet effet.

 

Conclusion: Les résultats obtenus suggèrent qu’en contexte inflammatoire, VCAM-1 contribue à l’adhésion des cellules tumorales au cerveau. Par conséquent, VCAM-1 peut représenter une cible thérapeutique attrayante pour réduire le risque de MC.

L’utilisation du microbiome intestinal pour la prédiction de lésions cancéreuses colorectales


Thierry Chénard1, Karine Prévost1, Mélina Arguin1, Jude Beaudoin1, Michael Desgagné1, Gabriel Robert1, Mandy Malick1, Jean Dubé1, Éric Massé1
1Université de Sherbrooke

Le cancer colorectal (CCR) est l’une des causes principales de mortalité liés aux cancers au Canada et mondialement. Le développement du CCR débute par la formation de polypes précancéreuse dans le côlon qui se développeront éventuellement en tumeurs cancéreuses métastatiques et invasives. La détection et le retrait précoce des polypes est critique à la survie des patients puisque cela prévient le développement du CCR et que le pronostique s’aggrave lors de l’établissement de tumeurs. Au Québec, le test immunochimique de recherche de sang occulte dans les selles (RSOSi) est communément utilisé pour prévoir la présence de polypes et de tumeurs. Dans environ 60% des cas, la présence de sang dans les selles détectée via le test RSOSi est indicative de polypes ou de tumeurs dans le côlon. Le département de Biochimie clinique du CHUS est responsable du test RSOSi pour le Québec et traite plus de 10 000 échantillons par semaine. L’importance du microbiome dans le développement de maladies comme le CCR est indéniable mais il reste encore majoritairement inutilisé comme marqueur de la progression du cancer. Nous avons donc investigué les signatures de microbiomes provenant de patients ayant différents degrés de pathologie intestinale. Pour ce faire, l’ADN génomique est isolé d’échantillons de selles provenant des tests RSOSi et une PCR est réalisée pour amplifier la 4ième région variable (V4) de l’ARN ribosomal 16S qui est ensuite séquencée. Cette région est flanquée de séquences hautement conservées permettant l’amplification du V4 de toutes les espèces bactériennes avec une seule paire d’oligonucléotides. Ce séquençage nous permet d’identifier les espèces bactériennes présentes dans les échantillons ainsi que leur abondance. Nous avons comparé les microbiomes des 450 patients avec un RSOSi positif avec ou sans lésions cancéreuses détectées par coloscopie (279 et 171, respectivement). Cette comparaison nous a permis d’identifier une variété de genres bactériens spécifiques à chaque conditions. De plus, nous avons produit un modèle prédictif utilisant les données de microbiome permettant une certaines capacité de différenciation entre les deux états. Nous espérons continuer à améliorer notre modèle prédictif pour montrer que l’utilisation du microbiome peut bonifier les résultats provenant du test RSOSi et ainsi réduire le taux de résultats faux-positifs y étant associé.

MODES D'INTERACTION NON CANONIQUES ENTRE LE RECEPTEUR TYROSINE KINASE (RTK) MET ET L'ISOFORME P66 DE LA PROTEINE SHC ET SA DUALITE DE FONCTION CELLULAIRE


Jesús GC Ojeda1, Stephen McManus1, Mélissa Landry1, Véronique Pomerleau1, Caroline Saucier1
1Université de Sherbrooke

Le RTK MET se lie aux trois isoformes de protéines adaptatrices codées par le gène SHCA. L'isoforme p52SHC est liée au MET pour déclencher l'activation de la voie mitogénique RAS / MAPK et la voie de survie PI3K. Ceci implique la phosphorylation de résidus de Tyrosine de p52SHC, formant des sites de liaison pour le domaine SH2 de la protéine adaptatrice GRB2; permettant la liaison du facteur d'échange guanylylique de RAS SOS1 et de la protéine d'échafaudage GAB1. En revanche, p66SHC déclenche l'inhibition de MAPK, l'apoptose sur le stress oxydatif et la confluence dans les cellules adhérentes, mais la résistance à l'anoïkis. De plus, alors que la liaison de p52SHC aux complexes MET et GRB2 / GAB1 repose sur l'activité MET, p66SHC interagit de manière constitutive avec eux d'une manière indépendante de pTyr.

 

Nous proposons la suivante hypothèse : l'état d'activation du RTK définit les différents complexes de protéines qui interagissent avec p66SHC, sous-jacents à sa double activité biologique. Nous identifierons l'interactome de p66SHC dépendant de l'état d'activation de MET en utilisant l’identification par biotine dépendant de la proximité (BioID, en anglais) couplée à la spectrométrie de masse (SM). En bref, la protéine de fusion biotine ligase-p66SHC sera exprimée avec TPR-MET, une forme constitutivement activée du RTK MET, ou un mutant TPR-MET avec un domaine kinase non-fonctionnelle. Par des analyses de l'ontologie génique des principaux liants candidats de p66SHC déterminés par MS, nous obtiendrons un aperçu de leur mode d'interaction et de leur rôle dans les processus biologiques de p66SHC et MET. Pour les liants de p66SHC pertinents et validés, leurs rôles seront définis par des études de gain et de perte de fonction.

 

Notre étude pourrait fournir une compréhension de la régulation dynamique dépendante de l'état d'activation RTK de l'interactome de p66SHC dans des cellules ainsi que de découvrir les mécanismes de sa double fonction cellulaire contextuelle.

Mutational signatures of alternative DNA repair pathways in human cancer cells


Samuel Zimmer1, Alexandre Maréchal1, Pierre-Étienne Jacques1
1Université de Sherbrooke

Genomic instability is a key factor in cancer development that is often driven by defects in DNA repair pathways. To understand the mutational processes involved in the formation of somatic mutations, a thorough identification of single nucleotide polymorphisms, indels and more complex rearrangements is necessary. Analyzing the patterns of somatic mutations can link precise mutational signatures to different DNA damage response and repair defects. These signatures provide valuable insights into the etiology of various cancers, but the algorithms used to identify somatic alterations and define mutational signatures are not yet optimized. Detecting more complex rearrangements could help find novel signatures associated with an increased use in alternative DNA repair pathways on which cancer cells rely to support their ongoing proliferation. In this study, we ran a set of recently released tools and custom scripts on high-performance computing (HPC) resources to find and classify somatic mutations in hundreds of publicly available breast cancer whole genome sequencing (WGS) data and compared our results to previous methods. Our goal is to accelerate the process, reduce the required resources and ultimately refine existing mutational signatures in human cancer cells.

Oncolytic reovirus modulates host cell alternative splicing landscape during infection through the μ2 protein


Simon Boudreault1, Guy Lemay2, Martin Bisaillon1
1Université de Sherbrooke 2Université de Montréal

Reovirus, a member of the Reoviridae family, is a double-stranded RNA virus that replicates in the cytoplasm. It infects the vast majority of mammals but does not cause any disease in humans. However, it replicates better in cancer cells than in normal tissues and is now one of the most promising oncolytic viruses, i.e., viruses used to treat cancer. REOLYSIN®, a wild-type T3D reovirus strain, is currently in stage 1 to 3 of clinical trials against various cancers. Alternative splicing (AS) is a mRNA maturation step allowing enhanced variability in mature mRNAs originating from the same gene, a process which is dysregulated in cancer cells. Recent evidence shows numerous cases of viruses altering cellular AS during infection, with a limited understanding of the role of these modulations in virus-host interactions. We wanted to investigate if reovirus alters host-cell AS during infection and the impact, if any, on viral replication. If modulation of cellular AS is beneficial for reovirus, its oncolytic activity and/or selectivity could be optimized based on its impact on AS. To study virus-driven modifications in the AS landscape of the host cell, mock and reovirus-infected L929 cells were analyzed at 15h after infection by high-throughput RNA-sequencing. We identified 240 AS events that were significantly modified during reovirus infection (Q<0.05). These 240 events affect genes enriched in RNA processing and maturation pathways, such as RNA splicing. RT-PCR analysis confirmed these modulations of AS in reovirus-infected cells. Cultivating L929 cells in the presence of infected cells does not lead to a change in AS by RT-PCR analysis, highlighting that the changes in AS require reovirus presence. Comparison between two different T3D strains revealed strain-dependent modulation in cellular AS. Using reassortant viruses, we were able to map this strain-dependent phenotype to the M1 gene, coding for the μ2 protein. The μ2 protein thus seems to be the primary determinant of reovirus modulation of cellular AS, and polymorphisms in this protein modulates its capacity to alter AS. Investigations are ongoing to explain how μ2 actually modulates AS and its role in viral replication. A thorough understanding of the role of AS in host-virus interactions might allow the design of better oncolytic reovirus, with either higher specificity or better oncolytic activity.

Pancreatic cancer cells require DNA-PK activity to support their growth


Rachita Chatterjee1, Benoit Marchand1, Marie-France Bossanyi1, Marie-Josée Boucher1
1Université de Sherbrooke

Introduction:

Pancreatic cancer (PDAC) is currently the 4th leading cause of cancer related deaths in Canada. The life expectancy with metastatic PDAC is 3-6 months. Malignant pancreatic tumours are one of the most intrinsically resistant tumours that can withstand majority of the currently available treatment modalities. The tumours are showing resistance to Gemcitabine, the most commonly prescribed drug. Gemcitabine is known to induce DNA damage that, if not repaired, leads to cell death. Of note, it was observed that PDAC tissues display higher expression of DNA-PKcs, the catalytic subunit of DNA-PK, suggesting that the DNA repair protein DNA-PKcs and/or the DNA-PK complex could provide a growth advantage to PDAC cells. Still, the role of DNA-PK in pancreatic pathophysiology remains elusive. Studies in the recent years have validated the high-basal levels of autophagy in PDAC cells and proven its importance in sustaining cell growth. It is noteworthy that agents inducing DNA damage have been correlated with autophagy modulation suggesting a potential link between autophagy-DNA damage and / or DNA repair mechanisms. However, the underlined mechanisms have yet to be identified.        

Aim: The overall objective was to interrogate a potential role for DNA-PK, increased in PDAC tissues, in regulating autophagy and growth of PDAC cells.

Methods:

The PDAC cell lines MiaPaCa-2 and PANC1 were used. The specific inhibitor NU7441 was used to block DNA-PK activity. Cell counting and clonogenic assays were performed to assess cell growth. Autophagic flux was measured by co-treatment with the autophagy inhibitor bafilomycin A1.

Results:

1) We observed a dose- and time-dependent decrease in cell number in DNA-PK inhibited cells as compared to control cells. 2) This coincides with the reduced colony forming ability of PDAC cells when treated with NU7441. 3) The impact on cell growth correlated with induction of cell apoptosis as measured by PARP and caspase-7 cleavage. 4) Given the reported role of autophagy in sustaining PDAC cell growth, we assessed the impact of DNA-PK inhibition on autophagy. Immunoblotting and immunofluorescence studies revealed that NU7441 treatment triggers increased expression of the autophagy receptor p62/SQSTM1 as well as lipidation of LC3B indicative of autophagy modulation. 5) Autophagy flux measurement supported blockade of autophagy upon DNA-PK inhibition.

Conclusion: Taken together, our results demonstrate that interference with DNA-PK activity is an attractive avenue to abrogate PDAC cell growth. Our observations support a novel role for DNA-PK in regulating autophagy. Given that PDAC tissues were shown to display high expression levels of DNA-PKcs, it is tempting to speculate that DNA-PK could be involved in maintaining high basal levels of autophagy as observed in PDAC cells.    

plateforme d'histologie et de microscopie électronique


Anne Vézina1
1Université de Sherbrooke

La plateforme d’histologie et de microscopie électronique offre aux professeurs, chercheurs, cliniciens et étudiants plusieurs services d’histologie et de microscopie, allant de la préparation de leurs échantillons biologiques humains ou animaux à leur analyse morphologique histologique, cellulaire et ultrastructurale.

La plateforme détient un savoir-faire et une expertise pour la réalisation de projets nécessitant des techniques d'histopathologie, de morphologie ultrastructurale, de localisation subcellulaire et d’isolation de tissus ou de cellules à partir de coupes histologiques ou de préparations cellulaires par microdissection laser (LCM).

L'équipe de la plateforme offre aussi un service d'immunohistochimie, d’immunofluorescence et d’immunogold pour évaluer l'expression de constituants cellulaire et subcellulaire spécifiques. 

Plateforme du Centre d’imagerie moléculaire de Sherbrooke (CIMS)


Jacques Rousseau1,2, Brigitte Guérin1,2, Roger Lecomte1,2, Martin Lepage1,2, Éric Turcotte1,2, Réjean Lebel1,2, Éric Lavallé2, Francis Malenfant2
1CIMS-CRCEL-CHUS 2Centre d'imagerie moléculaire de

La plateforme CIMS du CRCHUS offre un service clé-en-main d’imagerie afin de répondre à des questions de recherche spécifiques. L’imagerie est une approche non invasive et non terminale qui permet de suivre la pharmacocinétique de biomolécules in vivo afin d’évaluer leur potentiel diagnostique ou thérapeutique.

La plateforme met à votre disposition un éventail unique de modalités d’imagerie préclinique et clinique. Nous possédons une expertise reconnue en imagerie de tomographie d’émission par positrons/tomodensitométrie (TEP/TDM), de résonance magnétique (IRM) et de fluorescence/bioluminescence. Avec ses deux cyclotrons et son service de radiochimie, la plateforme offre une gamme étendue de radiotraceurs (C-11, N-13, F-18, Cu-64, Ga-68, Tc-99m, Zr-89) et de radiopharmaceutiques (FDG, FTHA, FLT, FET, FES/4FMFES, Acétate, Acétoacétate, Palmitate, DOTATATE, PIB, etc.). Nos laboratoires sont aussi activement engagés dans le développement de nouveaux agents pharmaceutiques (radiotraceurs, agents de contraste et sondes optiques) et de nouveaux imageurs pour l’imagerie aussi bien préclinique que clinique. Le centre possède toute l’infrastructure nécessaire à la validation des nouvelles sondes in vitro/in vivo, sur modèle animal et en milieu clinique. Son volet clinique dessert un vaste bassin de population et est activement impliqué dans la recherche en oncologie, cardiologie, métabolisme et neurologie.

Notre expertise s’étend de l’animal à l’humain : Venez nous rencontrer et discuter des possibilités. Nos experts en imagerie vous assisteront – du design expérimental jusqu’à l’interprétation des données.

 

Services :

  • Production de radioéléments
  • Radiochimie, marquage et développement de radiotraceurs
  • Développement de sondes radioactives, optiques et IRM
  • Designs expérimentaux
  • Protocoles d’imagerie standards en oncologie et cardiologie
  • Modélisation et analyse pharmacocinétique
  • Animalerie avec portoir ventilé et service de technicien animalier sur place
  • Infrastructure pour la mise en place et la réalisation d’études cliniques

 

Plateforme RNomique de l'Université de Sherbrooke


Mathieu Durand1,2, Elvy Lapointe1,2, Philippe Thibault1,2
1Plateforme RNomique de l'Université de Sherbrooke 2Université de Sherbrooke

La Plateforme Rnomique de l'Université de Sherbrooke offre un vaste éventail de services de séquençage de prochaine génération, de RT-PCR, et de bioinformatique à la communauté de recherche au Canada et ailleurs. La plateforme a été créée en 2006.

Nous fournissons un service complet de séquençage, depuis la préparation de la bibliothèque jusqu'au stockage et à l'analyse des données. Nous offrons une gamme de services à moyen débit sur les plateformes Illumina MiSeq™ et NextSeq™ 500. Les requêtes pour un séquençage plus profond sont référées aux centres génomiques partenaires pour le processus de séquençage lui-même, alors que nous prévalons sur la préparation de la bibliothèque et l'analyse des données.

Nous avons développé une plateforme computationnelle et expérimentale automatisée pour les recherches à grande échelle basée sur la RT-PCR. Les applications principales sont pour des études d'expression de gène par PCR par gouttelettes digitales (ddPCR), par RT-PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR), et pour l'annotation et l'analyse d'épissage alternatif par RT-PCR en point final couplée avec l'électrophorèse microcapillaire (ASPCR). Nous faisons la conception, l'exécution et l'analyse de milliers de réactions qRT-PCR et ASPCR par jour de façon routinière.

Nous offrons un service flexible et complet de préparation d'échantillon incluant l'isolement de l'ARN et de l'ADN, et le contrôle de la qualité à partir de source provenant de cultures cellulaires ou de tissus. Nous offrons aussi un soutien bioinformatique exhaustif pour la conception expérimentale et l'analyse des données couvrant un large champs d'application.

Les clients peuvent accéder à leurs résultats et à toutes les données expérimentales via un portail Web sécurisé. Le personnel expert de la plateforme est toujours disponible pour consultation directe à toutes les étapes de chaque projet. La plateforme développe continuellement de nouveaux essais et protocoles bioinformatiques pour répondre aux besoins de sa clientèle en expansion, qu'elle soit Université de Sherbrooke, académique canadienne ou externe, ou industrielle.

Platforme de bio-informatique et phénotypique du Département de Biologie de l'Université de Sherbrooke


Jean-Francois Lucier1, Daniel Garneau1
1Université de Sherbrooke

 

Le service bio-informatique et phénotypique du Département de Biologie de l’Université de Sherbrooke s’adresse aux différents chercheurs provenant du domaine académique et privée. L’offre de service comporte deux volets :

 

Service bio-informatique

Les besoins d’analyses bio-informatique sont en forte croissance depuis la dernière décennie. Le service bio-informatique a pour mission d’offrir aux chercheurs la possibilité de valider leurs hypothèses à l’aide de solutions bio-informatiques spécifiquement développées pour leurs besoins. Notre expertise bio-informatique acquise au fils des dernières années nous permet d'établir une solution de façon rapide, efficace et professionnelle à tous vos besoins bio-informatiques. Le service bio-informatique du département de Biologie travaille étroitement avec l'équipe du Centre de Calcul Scientifiques de l'Université de Sherbrooke (CCS), sous la gouverne de Calcul Québec et Calcul Canada. Cette association nous donne un accès privilégié à une grappe de calculs composée d’environ 40 000 processeurs ce qui permet à notre équipe d'analyser vos résultats de manière rapide et efficace.

 

Service de phénotypage

Le service de phénotypage du département de biologie met à la disposition des chercheurs plusieurs instruments de pointe incluant un microscope confocal, des microscopes à épifluorescence automatisés, des stéréomicroscopes, un trieur de cellules et des cytomètres analyseurs. Ce service comporte également un serveur de stockage d’images OMERO permettant le stockage de grandes quantités d’images et ce, de façon sécuritaire. OMERO supporte la grande majorité des formats d’image de microscopie et donne un accès facile aux images via un navigateur web. Il est possible d’y visualiser vos images, d’effectuer des mesures, de créer des figures directement sur le serveur ainsi que d’effectuer certaines manipulations d’image comme des ajustements de contraste ou encore la création de régions d’intérêt. La service offre également la possibilité d’effectuer l’analyse de vos images permettant ainsi de quantifier vos observations. Il est possible de créer des routines d’analyses d’images “custom” afin de faire l’analyse automatique d’une grandes quantités d’images ou encore de créer des analyses semi-automatisées permettant d’accélérer des prises de mesures ou des manipulations d’images devant être faites manuellement.

Portrait du devenir clinique des patients ayant subi une résection antérieure basse avec iléostomie temporaire de protection (ITP) et impact des complications liées aux ITP sur l’intégralité des protocoles de chimiothérapie adjuvante et la survie sans récidive.


M.Tremblay MD1, N.Amhis 1, A.Paré M.Sc1, M-C.Lavigne-Albert MD1, N.Mcfadden MD1
1Departement de chirurgie générale, Université de Sherbrooke

Introduction : Lors d'une résection antérieure basse (RAB) curative pour cancer du rectum, la réalisation d’une iléostomie temporaire de protection (ITP) est indiquée pour certains types de patients afin de réduire le risque de fuite anastomotique. L’objectif de cette étude est de dresser un portrait du devenir clinique des patients ayant subi une RAB avec ITP au CHUS, de même qu’évaluer le taux de complications associées aux ITP et leur impact sur l’intégralité des traitements de chimiothérapie adjuvante et la survie des patients.

Méthodologie : Étude de cohorte rétrospective auprès de tous les patients ayant subi une RAB pour un cancer du rectum avec ITP au CIUSSS de l’Estrie-CHUS entre le 5 juin 2007 et le 5 juin 2017.

Résultats : Parmi les 118 participants (42F:76H, âge médian 63[54-71]), 19 % (22/118) ont développé une complication spécifique à l’ITP. La complication d’ITP la plus fréquente (14/118) est la stomie à haut débit avec déshydratation secondaire. Bien que l’administration de chimiothérapie adjuvante était indiquée pour 95 des 118 patients, seulement 80 en ont reçu. Les délais causés par des complications postopératoires (de la RAB et/ou de l’ITP) étaient la cause de non-administration la plus prévalente. Le quart (20/80) des patients ayant initié une chimiothérapie adjuvante ont abandonné le traitement avant sa complétion, en majorité à cause d’une intolérance au traitement (11/20). Les patients ayant subi une complication d’ITP étaient significativement plus à risque de ne pas avoir complété leur traitement de chimiothérapie adjuvante (46 %) comparativement aux patients sans complication d’ITP (21 %, p=0.05).

Conclusion : Les complications spécifiques aux ITP nuisent significativement à l’intégralité des traitements de chimiothérapie adjuvante. Bien que les avantages de réaliser une ITP soient indéniables pour certains types de patients, le taux de complication associé demeure élevé (1 patient sur 5). Il serait pertinent d’évaluer si la fermeture précoce des ITP, avant le début de la chimiothérapie, pourrait favoriser le respect de l’intégralité des traitements de chimiothérapie adjuvante.  

Quantification of hypoxia in human glioblastomas with PET imaging


Redha-alla Abdo1, Frédéric Lamare2, Philippe Fernandez2, M'hamed Bentourkia1
1Université de Sherbrooke 2Université de Bordeaux- II

Hypoxia, known as an intracellular reduction of oxygen pressure, is one of the main characteristics of glioblastoma, and it constitute an important factor affecting treatment outcome. The common imaging method for hypoxia is with Positron Emission Tomography (PET) using the radiotracer 18F-fluoromisonidazole (18F-FMISO). Currently, few methods are used to quantify the tumor hypoxia with PET. These methods are either based on single acquisition time, or those based on dynamic acquisition providing a sequence of images till 4 h post radiotracer injection where the hypoxia retains the radiotracer producing high tumor contrast. In clinical settings, a single scan is acquired at a given time post injection and the degree of hypoxia is estimated by thresholding the image at a value 1.2 above tumor intensity divided by radiotracer intensity in blood (called tissue-to-blood ratio, TBR). The technique used for analyzing the dynamic PET images is the compartmental modeling analysis. The aim of this study was to determine the levels of hypoxia in glioblastoma PET images measured with 18F-FMISO by applying the compartmental modeling. Nine human subjects with GBM tumors were imaged with PET/CT and 18F-FMISO radiotracer in dynamic mode for 15 min followed with static scans at 2 h and 3 h post-injection. We used the two-tissue compartment model for kinetic modeling of the dynamic images at the voxel basis in order to obtain parametric images. These parametric images were further analyzed using Kmeans and elbow method to cluster the levels of hypoxia in the images. The resulting images produced by TBR at a threshold of 1.2 at imaging times of 15 min, 2 h and 3 h showed different clusters of hypoxia. Also, the comparison of TBR with the parametric images had a similarity index of 0.61 ± 0.05. Kmeans method was able to cluster the levels of hypoxia. The number of clusters was varied among the subjects. In conclusion, we found some variations in defining the hypoxic volume within a tumor using TBR. The compartmental analysis enabled the distinction of the tumor hypoxic sub-volumes which can be used for better treatment with radiotherapy.

Régulation de la stabilité du génome par les E3 ubiquitine ligases PRP19 et RFWD3


Maïlyn Yates1, Isabelle Marois1, Théo Morin1, Antoine Gaudreau-Lapierre1, Billel Djerir1, Alexandre Maréchal1
1Université de Sherbrooke

Le stress réplicatif est une source endogène majeure de stress génotoxique pouvant causer des mutations et des réarrangements dans l’ADN. L’accumulation d’erreurs durant la réplication de l’ADN est à la base du développement de pathologies telles que le cancer. Afin d’éviter le dérèglement de leur programme génétique, les cellules possèdent des mécanismes complexes de réponse aux dommages. La mise en place de cette réponse est médiée par la protéine de réplication A (RPA), qui reconnaît et recouvre simultanément la portion d’ADN simple brin (ADNsb) généré lors du blocage de la fourche de réplication afin de former la plateforme RPA-ADNsb essentielle à la signalisation, au recrutement et à l’activation de protéines cruciales pour la protection du génome. Ces différentes étapes de la réponse sont régulées par de nombreuses modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, l’ubiquitination, la sumoylation et l’acétylation.

 

Nous avons démontré que les E3 ubiquitines ligases PRP19 et RFWD3 ubiquitinent RPA pour favoriser la réparation de l’ADN. L’ubiquitination régulant plusieurs niveaux de la réponse aux dommages à l’ADN, notre hypothèse est que PRP19 et RFWD3 ubiquitinent différentes protéines sur la plateforme RPA-ADNsb pour conduire au redémarrage des fourches de réplication.

 

Par des analyses protéomiques des interacteurs de PRP19 et RFWD3 par spectrométrie de masse, nous avons identifié l’ATPase SMARCAL1 comme un nouveau partenaire de PRP19 et RFWD3. Connue comme une enzyme essentielle à la réversion et au redémarrage des fourches de réplication, nous avons déterminé que la fonction de SMARCAL1 dans la réponse au stress réplicatif est régulée par son ubiquitination.

 

Nous avons confirmé par microscopie confocale après microirradiation au laser UV la co-localisation de PRP19 et de RFWD3 avec SMARCAL1 aux sites de dommages sur RPA-ADNsb. Nous avons montré par des essais d’ubiquitination in vivo et in vitro que SMARCAL1 est ubiquitiné par PRP19 et RFWD3 en réponse au stress réplicatif. La suite de nos travaux vise à déterminer l’importance fonctionnelle de l’ubiquitination de SMARCAL1 par PRP19 et RFWD3 dans le redémarrage des fourches de réplication. Une meilleure compréhension du mécanisme de réparation des dommages en réponse au stress réplicatif permettrait l’identification de cibles potentielles pour la sensibilisation des cellules cancéreuses aux traitements chimiothérapeutiques.

Regulation of colorectal cancer cell differentiation through the Hippo pathway


Sepideh Fallah1, Jean-Francois Beaulieu2
1Université de Sherbrooke 2Université de Sherbrooke

Self-renewal of the human intestinal epithelium is supported by LGR5+ crypt base columnar (CBC) stem cells that are located at the base of the crypt. The stemness of CBC cells is influenced by different pathways and factors including Wnt, Notch and Hippo pathways. YAP is an effector of the Hippo signaling pathway that is inactivated by phosphorylation. Phosphorylated YAP cannot transfer to the nucleus and is recognised by the 14.3.3 protein for proteasomal degradation. In the nucleus, active YAP forms a complex with the TEAD transcription factor and activates proliferation related genes. As a preliminary result, the nuclear expression of YAP was detected in a few cells of the human intestinal crypt that are located in the stem cell compartment. Also, a high expression of YAP protein and RNA was detected in HT29 cells, a colon cancer cell line that contains a small population of stem cells. In this study, in order to investigate the role of YAP in cancerous stem cell maintenance, we suppressed YAP expression in HT29 cells using shRNA.

By qPCR analysis, we found that LGR5 expression was decreased in YAP knock down cells as expected. However the expression of MUC2 and TFF3 (goblet cell markers) and SI and DPP4 (absorptive cell markers) was found to be significantly increased at both the transcript and protein levels as compared to control cells.  

We conclude that YAP promotes stemness but can also be involved in inhibiting overall intestinal differentiation by affecting the two main lineages, absorptive and secretory.

Repurposing chloroquine as an anti-glioblastoma therapeutic.


Laurent-Olivier Roy1, Marie-Belle Poirier2, David Fortin2
1Université de Sherbrooke, département de pharmacologie 2Université de Sherbrooke, département de chirurgie

BACKGROUND. Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive type of primary brain tumor in adults. The GBM phenotype is characterized by rapid proliferation, intense brain infiltration and resistance to radio-/chemotherapy which impedes the complete surgical resection and leads to transitory responses to standard therapy. Recurrence is thus inevitable and the prognosis falls short of 15 months. Transforming growth factor-beta (TGF-b) strongly supports these features. We showed that TGF-b1 correlates with de novo GBM patient outcome and that chloroquine (CQ), a renowned anti-malarial drug, can block TGF-b production and inhibit proliferation, invasion, radioresistance as well as radio-induced invasion in vitro. Unfortunately, the ability of CQ to cross the blood-brain barrier (BBB) is poorly referenced. Therefore, we want to evaluate if intravenous (IV) or intra-arterial (IA) infusions of CQ and hydroxychloroquine (HCQ), an analogue of CQ, can yield therapeutic brain concentrations.

 

RESULTS. In tumor-free Wistar rat, we harvested the brain, plasma and cerebrospinal fluid (CSF) 15 minutes post-IV and post-IA infusions with 20 mg/kg of CQ/HCQ and evaluated the concentration of both molecules by LCMS/MS. Our results show that following IV injections, CQ/HCQ brain concentrations were 0.18 and 0.078 µM respectively. However, with IA infusions, we observed a 1.74 and 20.9 fold-increase (HCQ) and 7.1 and 84.7-fold-increase (CQ) in contra- and ipsilateral brain concentrations respectively. Whereas plasma concentrations were very similar following IV and IA infusions, both molecules barely accumulated in CSF and only following IA infusion.

 

CONCLUSIONS. These results suggest that IA CQ could be used to abrogate the GBM phenotype. We thus want to characterize the kinetics of brain distribution so that we can assess CQ’s anti-GBM properties in vivo both alone and in combination with chemotherapy or radiation.

Rétrocontrôle de la signalisation Wnt/b-caténine par la tyrosine phosphatase Shp1 dans l’épithélium intestina


Caroline Leblanc1, Nathalie Rivard1
1Université de Sherbrooke

Shp1 est une tyrosine phosphatase exprimée dans les cellules hématopoïétiques où elle est connue pour son rôle antiprolifératif. Bien qu’exprimée plus faiblement dans les épithéliums, dont l’épithélium intestinal, son rôle y reste peu connu. Dans un modèle de souris invalidée pour Shp1 dans cellules épithéliales intestinales (CEIs) (Shp1CEI-KO) nous avons noté une hyperactivation de la voie Wnt/b-caténine caractérisée par la stabilisation protéique de la b-caténine, de même que par une augmentation de sa localisation nucléaire, et de l’expression de ses gènes cibles. La voie Wnt/b-caténine étant caractérisée comme cruciale pour la prolifération des cellules souches et impliquée dans la tumorigénèse intestinale, nous avons voulu déterminer si Shp1 jouait un rôle dans la signalisation Wnt/b-caténine et le cancer colorectal.

 

Pour évaluer l’impact de la perte de Shp1 sur les cellules souches, des organoïdes ont été générés à partir des intestins des souris Shp1CEI-KO. De façon intéressante, les organoïdes invalidés pour Shp1 se développent moins que les organoïdes contrôles, bien que plus de cellules prolifératives ont été observé par incorporation d’EdU. Finalement, une réduction de la quantité de R-Spondine dans le milieu de culture des organoïdes, essentielle à l’activation de la signalisation Wnt/b-caténine, restaure le développement des organoïdes expérimentaux. Ces résultats suggèrent que Shp1 régule négativement cette voie, impliquée dans le développement du cancer colorectal.

 

Nous avons donc mesuré l’expression de Shp1 dans différentes lignées cellulaires colorectales normales ou cancéreuses. De façon intéressante, l’expression de Shp1 est augmentée dans les cellules possédant une mutation activatrice de la voie Wnt/b-caténine. De plus, des analyses bioinformatiques prédisent que le promoteur de Shp1 possède des éléments de réponse pour LEF1/TCF, impliqués dans la signalisation Wnt/b-caténine. Ces observations suggèrent donc que l’expression de Shp1 pourrait être régulée par cette voie de signalisation.

 

Nos résultats montrent donc que l’expression de Shp1 semble dépendante de la voie Wnt/b-caténine et vice versa, indiquant qu’il pourrait exister un rétrocontrôle négatif de cette signalisation qui passerait par l’expression de Shp1. Ainsi, Shp1 pourrait être un des rares cas connus où la voie Wnt/b-caténine inhibe la transcription d’un gène lorsqu’elle est activée et pourrait agir comme un frein lors du cancer colorectal.

Rôle de la myotubularine Sbf, une protéine régulant l’autophagie, dans la différenciation des cellules intestinales.


Camille Lacarrière1, Steve Jean2
1Université de Sherbrooke 2Université de Sherbrooke

    Les voies impliquées dans le devenir de la cellule souche sont perturbées dans les cellules cancéreuses. L’autophagie joue un rôle important dans le maintien du caractère souche des cellules souches hématopoïétiques ou la différenciation des cellules neuronales par exemples. Le niveau du flux autophagique, c’est-à-dire la vitesse avec laquelle le processus dégrade les composés intracellulaires par les lysosomes, influe sur le devenir de la cellule. Il serait important de comprendre le rôle de l’autophagie dans les cellules souches pour comprendre son implication dans les cellules cancéreuses.  La myotubularine Sbf régule le flux autophagique et ce de façon conservée entre les espèces. Lors d’une carence en nutriment, Sbf, active la petite Rab GTPase, Rab21, pour induire le triage endosomal d’une protéine indispensable à la fusion de l’autophagosome avec les lysosomes, nécessaire pour dégrader son contenu. De façon intéressante, un criblage génétique chez la drosophile suggère un rôle pour Rab21 dans la prolifération des cellules souches intestinales. De ce fait, nous supposons qu’une autophagie dysfonctionnelle causée par la perte de Sbf perturbera le renouvellement de l’épithélium intestinal de la drosophile.

 

    Comme chez les mammifères, le « midgut » de la drosophile, équivalent à notre intestin grêle, la cellule souche se divise en cellule souche et en cellule progénitrice qui se différenciera soit en cellules absorbant les nutriments : les entérocytes ou soit en cellules sécrétrices d’hormones: les entéroendocrines. En utilisant des lignées transgéniques de drosophile permettant l’expression inductible et tissu spécifique d’ARN interférents, Sbf a été déplétée dans les cellules souches ou progénitrices. Ainsi, l’effet de la perte de MTMR13 sur les différents types cellulaires de l’intestin a été étudié par microscopie confocale.

 

    Les résultats montrent que la perte de Sbf ou de Rab21 dans les cellules souches et progénitrices entraîne l’hyperprolifération des précurseurs et notamment des pré-entéroendocrines. Ceci est corrélé à une augmentation du nombre de cellules entéroendocrines et ce phénomène semble indépendant de la microflore intestinale. Sbf jouerait un rôle dans la régulation de la différenciation progénitrices en entéroendocrines et ce de façon intrinsèque à la cellule. Le phénotype obtenu étant similaire à la perte de Rab21, il faudra déterminer s’il dépend de sa fonction dans l’autophagie.

Role of Krt15+ stem cells in esophageal squamous cell carcinoma


Julie Douchin1,2, Véronique Giroux1,2
1Department of Anatomy and Cell Biology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke 2Theme Cancer: Biology, Prognosis and Diagnosis, Centre de Recherche du CHUS, Sherbrooke

BACKGROUND: In Canada, patients with esophageal cancer have a 5-year survival rate of only 14%, the 2nd worst in 2017. Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is the most common esophageal cancer worldwide. Risk factors include alcohol use, consumption of hot beverages and esophagitis. Esophagitis is developed upon several insults (e.g. acid/bile reflux, radiation, infection). Epithelial damages typically trigger activation of stem cells which will orchestrate tissue regeneration. The existence of esophageal stem cells remained controversial until our studies. We recently identified that Krt15 promoter marks a subpopulation of esophageal basal cells which display self-renewal and multipotent capacities, characteristics consistent with a stem cell population. Our preliminary results suggest that Krt15 esophageal cells have tumor-initiating capacities in mouse. However, we still ignore the role of these cells at later stages of the disease. Cancer stem cells (CSCs) have been linked to treatment resistance and poor survival rate. Therefore, the characterization of esophageal CSCs is a promising strategy to improve survival and treatment in ESCC patients. In this study, we aim to isolate Krt15 esophageal cancer cells, characterize their CSC properties and their resistance to chemotherapeutic agents.

METHODS: The carcinogen 4-nitroquinoline 1-ozide (4NQO) is used to induce oral-esophageal lesions in mouse that morphologically resemble human ESCC. Krt15-CrePR1;Rosa26mTomato/mGFP mice are treated with 4-NQO in the drinking water and expansion of Krt15+ (GFP-labeled) cells was measured.

RESULTS: To determine the role of Krt15+ cells in esophageal tumor initiation, we treated Krt15-CrePR1;Rosa26mTomato/mGFP mice with 4-NQO. We observed that Krt15+ cells expand in the esophageal lesions. The size of the clones formed by Krt15+ cells (GFP-labeled) is higher in mice treated with 4-NQO than in control mice suggesting that Krt15+ cells contribute to ESCC expansion. Interestingly, in human ESCC tumors, we observed that K15 expression is localized at the tumor migration edges suggesting a role for K15 in migration and invasion. Furthermore, we isolated esophageal tumors from WT mice treated with 4-NQO. We observed that K15 expression is also increased in the invasive front of mouse esophageal tumors. Finally, we quantified the expression of Krt15 transcript in mouse ESCC cell lines which harbor variable tumorigenicity and aggressiveness. We observed that Krt15 expression correlated with the aggressiveness of ESCC mouse cell lines.

CONCLUSION: Our results support that Krt15+ stem cells play a role in ESCC initiation and progression suggesting that targeting these stem cells might be a therapeutic approach to improve survival of ESCC patients.

Snazarus et RAB21 des acteurs de l’autophagie aussi impliqués dans la biogenèse de gouttelettes lipidiques


Marie-France Bossanyi2, Marie-Josée Boucher1, Steve Jean3
1Université de Sherbrooke 2Université de Sherbrooke 3Université de Sherbrooke

Le trafic membranaire est un processus essentiel au maintien de l’homéostasie cellulaire. Celui-ci permet entre autres la progression du flux autophagique. L’autophagie est un processus d’adaptation hautement activé dans certains cancers puisqu’elle permet le recyclage des composantes cytoplasmiques et organelles cellulaires en réponse au stress. Parallèlement à l’autophagie, la lipophagie permet la dégradation par les lysosomes des lipides emmagasinés dans les gouttelettes lipidiques. Il existerait une interconnexion/interrelation entre l’autophagie et la biogenèse des gouttelettes lipidiques qui est encore peu connue. C’est donc dans cette optique que se positionne mon projet.

Les recherches au laboratoire sur le trafic membranaire aux endosomes précoces ont observé que la perte de Snazarus, chez la drosophile, phénocopie la perte de RAB21, une petite GTPase, requise lors du processus autophagique. Plus particulièrement, Snazarus régule tout comme RAB21, le trafic vésiculaire de VAMP8 qui est impliquée dans la fusion autophagosome-lysosome.  Il a été démontré que l’orthologue de Snazarus chez la levure, mdm1, est impliqué dans la formation de gouttelettes lipidiques au point d’intersection entre le réticulum endoplasmique et la vacuole. Ainsi, Snazarus pourrait être impliquée dans la formation de gouttelettes lipidiques et liée au métabolisme des lipides, puisque Snazarus est grandement exprimée dans le corps gras des drosophiles. De manière intéressante, une étude protéomique a noté la présence de RAB21 au niveau des gouttelettes lipidiques et une autre a observé un changement de la taille des gouttelettes lipidiques avec un dominant négatif de RAB21. Étant donné le lien fonctionnel entre Snazarus et RAB21 dans le trafic de VAMP8 et leur potentiel rôle individuel dans la biogenèse des gouttelettes lipidiques, on peut supposer que Snazarus et RAB21 collaborent lors de la formation des gouttelettes lipidiques chez la drosophile. Mes travaux ont permis de démontrer que la localisation de Snazarus était affectée par la perte de RAB21 dans les corps gras de drosophile. J’étudie maintenant le lien fonctionnel entre Snazarus et RAB21 lors de la formation de gouttelettes lipidiques. Ainsi, nos études permettront de comprendre la relation entre l’autophagie et la régulation des gouttelettes lipidiques.

SOCS-dependent regulation of hepatocarcinogenesis


Md Gulam Musawwir Khan 1, Mehdi Yeganeh1, Sheela Ramanthan1, Subburaj Ilangumaran1
1Department of Anatomy and Cell biology, Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada

Suppressor of cytokine signaling (SOCS) proteins SOCS1 and SOCS3 function as tumor suppressors in the liver. Deficiency of either SOCS1 or SOCS3 results in increased susceptibility to hepatocellular carcinoma (HCC). Whereas SOCS3 is implicated in attenuating STAT3 activation, we have shown that SOCS1 controls the oncogenic functions of HGF receptor MET and p21CIP1/WAF1 (p21). Ablation of Cdkn1a abolished the increased susceptibility of SOCS1-deficient mice to diethylnitrosamine (DEN)-induced HCC. SOCS1 can activate p53, a transcriptional activator of the Cdkn1a gene, which codes for p21. Surprisingly, loss of SOCS1 results in increased expression of p21 both at mRNA and protein levels in the liver following genotoxic stress. SOCS3 can also activate p53 and has been reported to promote p21 expression. Therefore, we investigated the disparate regulation of p21 by SOCS1 and SOCS3, and its implications to HCC using mice lacking SOCS1, SOCS3 or both in the liver. Whereas the loss of either SOCS1 or SOCS3 increased DEN-induced HCC, ablation of both SOCS proteins attenuated HCC progression. We show that increased SOCS3 expression underlies increased p53 activation and p21 expression in the livers of SOCS1-deficent mice. Increased p21 levels can modulate cellular oxidative stress via stabilizing NRF2. We show that loss of p21 in SOCS1-deficient livers attenuated the induction of Nfe2l2 coding for NRF2 and its target genes. Overall, our findings indicate that a compensatory increase in SOCS3 expression in SOCS1-deficient liver augments p21 expression, which in turn enhances NRF2-mediated antioxidant functions and promotes hepatocarcinogenesis.

Split BioID : Développement de la complémentation de fragments de biotine ligases afin d’augmenter la résolution dans la détection d'interactions protéines-protéines


Gabrielle Tapp1, Dominique Lévesque1, François-Michel Boisvert1
1Département d’Anatomie et Biologie Cellulaire, Faculté de médecine et sciences de la Santé, Université de Sherbrooke

La nature dynamique et la complexité des interactions protéiques est un défi majeur dans la caractérisation des fonctions des protéines en biologie cellulaire. Différents outils techniques ont donc été développés afin de caractériser les interactions protéiques. Parmi ceux-ci, le système de biotinylation par proximité (BioID) utilise l’activité enzymatique de la biotine ligase BirA* pour marquer à la biotine les protéines à proximité d’une protéine d’intérêt, qui peuvent ensuite être identifiées par spectrométrie de masse. Cependant, cette approche permet la biotinylation par l’enzyme à partir de sa traduction par le ribosome, et résulte en un marquage à la biotine qui correspond à un ensemble des complexes et compartiments cellulaires dans lesquels la protéine d’intérêt a transité dans le temps. Ce projet consiste à développer et optimiser la technique de complémentation de fragments protéiques par BioID, nommé Split BioID, qui permettra de restreindre l’activité enzymatique de BirA* dans des conditions spécifiques en utilisant l’interaction entre deux protéines. L’enzyme biotine ligase BirA* sera clivée en deux fragments non-fonctionnels et chaque fragment sera fusionné avec des protéines d’intérêt dont les interactions directes ont déjà été confirmées dans le laboratoire. Comme preuve de concept, les interactions entre les protéines MCM2/ASF1 ainsi que MCM3/MCM5 seront utilisées afin de reconstituer l’activité de BirA*. Les différentes constructions plasmidiques seront transfectées dans des cellules, et l’activité enzymatique de la biotine ligase sera mesurée par immunobuvardage en utilisant la streptavidine-HRP, ainsi que par immunofluorescence en utilisant la streptavidine couplée à un fluorophore. L’optimisation du système de Split BioID se fera à partir de différentes combinaisons d’étiquettes/espaceurs (3MYC ou 3FLAG), de plasmides, (fusion N-terminale ou C-terminale) et de fragments de la biotine ligase (fragment N-terminal ou C-terminal). Ce système servira à confirmer des interactions protéiques qui ont déjà été répertoriées et contribuera améliorer la détection de protéines dans des contextes précis afin d’identifier le rôle de ces interactions protéiques impliquées dans diverses voies de réponses aux dommages à l’ADN.

Study of mutational signatures associated with replication stress in human cancer cells


Lisa Casimir1, Samuel Zimmer1, Pierrre-Etienne Jacques1, Alexandre Maréchal1
1Université de Sherbrooke

Eukaryotic cells need to duplicate their DNA to promote the faithful vertical transmission of genetic information. However, this process can be jeopardized by DNA replication stress, one the major source of mutations and genomic rearrangements in pre-cancerous cells. In response to this stress, the DNA Damage Response (DDR) is triggered by the master checkpoint kinase ATR which controls cell cycle arrest, DNA repair and replication fork stabilization and restart. ATR inhibition generally increases replication stress to levels that are unsustainable for cancer cells in which the DDR is often compromised, and baseline replication stress is already elevated. ATR inhibitors are thus currently in clinical trials for a host of cancer types as single agents or in combination with classic chemotherapeutic agents. Despite this, the genome-wide consequences of ATR inhibition and DNA replication stress remain poorly characterized. Additionally, the cancer types that may benefit the most from ATR inhibition are not well defined.

 

The aim of this project is to delineate the mutational signatures associated with replication stress in human cancer cells. To do so, we will induce replication stress via nucleotide pool depletion using hydroxyurea or gemcitabine treatment or via ATR inhibition using two independent ATR inhibitors (VE-821 and AZD6730) in chronic myelogeneous leukemia HAP1 cells. Treatments will be performed using TP53+ and TP53- HAP1 cells to examine the influence of this critical tumor suppressor on the genome-wide consequences of replication stress. A bioinformatics pipeline will be used to identify somatic point mutations and rearrangements (insertions, deletions, translocations and duplications) induced by replication stress-inducing agents in these 2 genetic backgrounds. Non-negative matrix factorization tools will subsequently be used to derive mutational signature of replication stress and ATR inhibition. These signatures will be compared to those derived from human cancer cell lines to pinpoint those undergoing strong endogenous replication stress. The sensitivity of these cell lines to ATR inhibition will be tested to determine whether whole genome sequencing technologies could be leveraged to inform treatment options using current generation DDR inhibitors.

Surgical trauma induces postoperative natural killer cell dysfunction in colorectal cancer patients through the NKG2D-NKG2DL pathway


Orneala Bakos1, Seyedeh Niavarani1, Francis Bernier Godon1, Christine Lawson1, Lee-Hwa Tai1,2
1Université de Sherbrooke 2Centre de Recherche du CHUS

Background and Rationale: Natural killer (NK) cells play a key role in the innate elimination of virally infected or malignant cells, but they can be circumvented by immunoevasion mechanisms enabling viral spread or tumor progression.  Engagement of the NKG2D activating receptor with soluble forms of its ligand (sNKG2DL) is one such mechanism of inducing NK cell hypo-responsiveness. However, this immunoevasion strategy has not been described in the postoperative period where tolerance of damaged self-cells is necessary to promote tissue repair.  We have previously found that mice subjected to surgical trauma demonstrate decreased expression of NKG2D on NK cells and impaired NK cell functionality.  Importantly, these dysfunctional NK cells could not eliminate postoperative metastases in mice models of colorectal cancer and surgery. This prompted us to investigate the NKG2D-sNKG2DL pathway and its contribution in promoting postoperative metastasis in human colorectal cancer surgical patients.

Hypothesis: We hypothesize that sNKG2DL increases in the plasma of colorectal cancer patients following their surgery and this contributes to impaired NK cell mediated elimination of postoperative metastases.

Methods: We have initiated a perioperative blood collection study to measure NKG2D receptor levels on peripheral blood NK cells and sNKG2DL in plasma of colorectal cancer surgical patients.  Using flow cytometry, ELISA and ex vivo functional immune assays, we will determine if targeting sNKG2DL in the postoperative period will alleviate NK cell impairment.  

Results:  We have found decreased levels of NKG2D NK cell expression and functionally impaired NK cells in the postoperative period. We have additionally observed that sNKG2DLs are present at elevated levels in the plasma of postoperative patients and this is associated with reduced CD107a expression and IFNγ production by NK cells.

Conclusion: Our results suggest that sNKG2DL are secreted in postoperative plasma as a potential mechanism of host tolerance to injured cells. However, this host-induced NK cell immunosuppression is being exploited by tumor cells to escape and proliferate. Investigating the NKG2D-sNKG2DL immunoevasion pathway following surgery will provide mechanistic insight and potential therapeutic avenues to target post-surgery metastasis that exploit immune suppression following surgery.  

Targeting metastatic Triple Negative Breast cancer with an immunogenic cancer cell vaccine


Seyedeh Niavarani1, Christine Lawson1, Lee-Hwa Tai1,2
1Université de Sherbrooke 2Centre de Recherche du CHUS

Triple-negative breast cancer (TNBC), so named because it lacks estrogen, progesterone, and HER2 receptors accounts for 15% of all invasive breast cancers.  However, it is responsible for a large proportion of breast cancer deaths because it is very aggressive and is more likely to have metastasized at diagnosis.  TNBC is currently only treated with surgery and chemotherapy, as it does not respond to hormone and HER2-targeted biotherapies.  Compared to other breast cancer types, TNBC has higher rates of genetic mutations and contains more tumor-infiltrating lymphocytes.  These characteristics implicate the production of more neoantigens and increased immunogenicity in the TNBC microenvironment, which provides a strong rationale to use immunogenic autologous tumor cell vaccines to therapeutically target TNBC.  The goal of this project is to link multiple tumor-associated antigens from patient-derived tumors with potent danger signals derived from oncolytic Vesicular Stomatitis Virus (VSV) infection, as a personalized whole tumor cell vaccine to activate tumor-directed innate and adaptive immune responses.  The specific aims are to: 1) characterize the mechanisms of vaccine induced immune activation using the mouse and human TNBC cell lines and 2) evaluate vaccine induced immune responses in vivo using syngeneic and humanized TNBC mouse models.  Using molecular, cellular and functional assays, our preliminary results suggest that TNBC cells undergo immunogenic necrosis following VSV infection.  Furthermore, we detected enhanced NK and T cell function and reduced lung tumor burden following vaccination in the BALB/c-4T1 syngeneic model.  These promising results demonstrate the therapeutic potential of immunogenic tumor vaccines to treat TNBC.

TBC1D25 et son implication dans la régulation négative de RAB21


Caroline Normandin1, Steve Jean1
1Université de Sherbrooke

Le cancer est une des premières causes de décès au Canada. Malgré de nombreuses avancées pour traiter cette maladie, plusieurs types de cancers développent une résistance aux traitements en plus d’être aptes à former des métastases. Il est donc important de mieux comprendre les processus d’acquisitions de résistance et de formation de métastases. Certaines protéines, telles que RAB21, contribuent à la résistance aux traitements et à la formation de métastases. En effet, RAB21 est impliquée dans le trafic membranaire, la migration, la réponse au stress et la prolifération cellulaire, respectivement via la régulation du recyclage de cargo, la régulation de l’internalisation des intégrines, la régulation de l’autophagie ainsi que la régulation de l’internalisation du récepteur à l’EGF. Tous ces processus sont finement régulés et la régulation de RAB21 est donc essentielle. L’activation de celle-ci se fait par les Guanines Nucleotides Exchanges Factors (GEFs) et sa désactivation est effectuée probablement par une ou plusieurs GTPases Activating Proteins (GAPs). À ce jour, aucune GAP pour RAB21 n’a été identifiée. Pour identifier une GAP ciblant RAB21, un criblage génétique chez la drosophile a été effectué révélant plusieurs GAPs potentielles. D’abord des expériences d’interactions protéiques ont montré que seule la GAP TBC1D25 interagissait avec RAB21 et que cette interaction était dépendante de son activité catalytique. De plus, des essais in cellulo ont montré que cette interaction était augmentée par la carence nutritionnelle. Par la suite, des essais biochimiques ont montré que la surexpression de TBC1D25 diminuait l’activation de RAB21. Des essais in vivo dans les corps gras de larves de drosophiles ont montré que la surexpression de TBC1D25 provoquait un blocage de l’autophagie. Mes travaux ont aussi montré que la surexpression de TBC1D25 empêchait la formation de tubules endosomaux, importants dans le trafic membranaire. Tous ces résultats semblent indiquer que TBC1D25 est une GAP pour RAB21 et qu’elle peut être impliquée dans divers processus liés à l’évolution du cancer. En somme, l’identification d’une GAP pour RAB21 pourrait permettre d’inactiver RAB21 dans différents processus tumoraux et donc d’affecter plusieurs processus pro-oncogéniques. La régulation de RAB21 par TBC1D25 ainsi que TBC1D25 seront étudiées davantage afin d’investiguer de possibles avenues thérapeutiques.

The development of personalized CAM Avatar model to predict chemotherapeutic drug sensitivity/resistance of gliomas.


Martine Charbonneau1, Laurent-Olivier Roy1, Maxime Richer1, david fortin1, Claire Dubois1
1Université de Sherbrooke

Malignant glial tumors are associated with a poor prognosis, presenting a short median patient survival and a very limited response to therapies. Although the first line therapy is standardized, there exists no consensus as to which second line treatment modality could be the most effective. We thus sought to demonstrate the feasibility of transforming our newly established expertise into personalized treatments for glioma patients by developing an advanced in vivo Avatar model developed from patient-derived tumors. The typical medical Avatar system entails implantation of patient tumor samples in immunodeficient mice for subsequent test in drug efficacy. As the generation of mouse Avatars is a slow and costly approach, many cancer patients are set to have a significant disease progression before the results from the mouse model become available. We recently developed a rapid and cost-effective, pre-clinical model that is well suited for precision medicine – the ex-ovo chicken embryo ChorioAllantoic Membrane (CAM) assay. We will present data indicating that tumor growth occurs very rapidly in ex ovo CAMs, with measurable tumors obtained within a few days, as opposed to several weeks in mice. Even though tumor sizes are smaller in the CAM than in mice, the engrafting rate is higher and tumor sizes are more uniform. Implantation of glioma tissue fragments from 38 patients led to the successful establishment of CAM xenograft tumors which faithfully recapitulate the histology of the primary tumor for the majority of patients. Furthermore, a significant inhibition of tumor growth in CAMs treated with first and second line chemotherapeutic drugs was observed. This next-generation Avatar model could become an asset for personalized medicine in gliomas treatment.